Permeabilization av levd Cells Bruke en Inert Gas Jet

Summary

Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for midlertidig permeabilization av adherente celler ved hjelp av en inert gass-stråle. Denne teknikk muliggjør overføring av genetisk materiale og biomolekyler i adherente pattedyrceller ved anvendelse av mekaniske krefter for å forstyrre plasmamembranen.

Abstract

Ulike celle transfeksjonsteknikker eksisterer, og disse kan bli brutt ned til tre hovedkategorier: viral, kjemiske og mekaniske. Denne protokollen beskriver en mekanisk metode for å temporært permeabilize adherente celler ved hjelp av en inert gass-stråle som kan lette overføringen av normalt ikke-gjennomtrengelige makromolekyler inn i cellene. Vi tror at denne teknikken virker ved formidling av skjærkrefter på plasma membran av adherente celler, som resulterer i den midlertidige dannelse av mikroporer. Når disse porene er opprettet, cellene blir deretter gjennomtrengelig for genetisk materiale og andre biomolekyler. De mekaniske krefter involvert kjører risikoen for permanent skade eller demonterer celler fra deres substrat. Det er derfor et smalt spekter av inerte gassdynamikk hvor teknikken er effektiv. En inert gass jet har vist seg effektiv på permeabilizing ulike heftcellelinjer inkludert HeLa, HEK293 og menneske abdominale endotelceller. Denne protokollen er hensiktsmessig for permeabilization av adherente celler både in vitro og, som vi har demonstrert in vivo, viser det kan benyttes for forskning og potensielt i fremtidige kliniske anvendelser. Den har også fordelen av å permeabilizing celler i en romlig restriktiv måte, noe som kan vise seg å være et verdifullt forskningsverktøy.

Introduction

Med utviklingen av biomedisin og forståelse av celle mekanikk, har levering av biomolekyler i celler blir avgjørende for mange forskningsfelt og medisinske terapier. Forskjellige teknikker har blitt utviklet for å innføre fremmede molekyler gjennom plasmamembranen og inn i cellens cytosol. Disse kan generelt klassifiseres som enten: viral, kjemiske eller mekaniske teknikker. Virale teknikker kan transfektere genetisk materiale, slik som RNA-og DNA ved hjelp av virale vektorer ^en. Virale teknikker har en tendens til å ha høy effektivitet i visse cellelinjer, men de har potensiale for immun-og inflammatoriske reaksjoner ^to. Vanlige kjemiske transfeksjonsmetoder inkluderer nedbør med kalsiumfosfat ^3, bakterielle exotoxins ⁴ og lipofection ^fem. Disse teknikker har vist seg å være effektivt, men det oppstår visse problemer, slik som celletoksisitet og ikke-spesifisitet. Videre teknikker som kalsium fosfate ventet har blitt funnet å ha transfeksjon virkningsgrader opp til 70%, men bare i visse cellelinjer, sjelden i primærceller ^6. Det er verdt å merke som øker forskningsinnsats blir satt inn i primærceller, spesielt i tilfellet med utforming av forskjellige behandlinger for klinisk bruk, og studiet av DNA-funksjon.

Temporal forstyrrelse av cellemembranen via mekaniske stimuli er et alternativ for innføring av fremmede molekyler inn i celler. Teknikker omfatter: mikroinjeksjon av molekyler ^7, elektroporering ved å bruke et elektrisk felt for å bryte membranen ^8,9, sonoporation ved hjelp av ultralydbølger for å forstyrre cellemembranen ^10-12, partikkel bombardement som demonstrert ved "genet gun", som skyter partikler bundet med gener inn i cellen ^13, og mer nylig, påføring av fluidskjærspenning som har vist seg å temporært permeabilize pattedyrceller ^14,15. Selv mekanikeral metoder unngå noen av de nevnte problemene, de er vanligvis ledsaget av lavere effektivitet og svært komplekse og spesialiserte oppsett. En atmosfærisk trykk glød utslipp lommelykt (APGD-t) ble utviklet ved McGill med den opprinnelige målet av funksjon overflater og løsne heftende celler in vitro ^16. Serendipitously, ble det oppdaget at en levende / død flekken blir brukt var liksom å bli tatt av celler uten permeabilizing middel tilsettes. Videre, dette syntes å ha skjedd bare i begrensede områder av brønnene som skjedde for å matche opp med fakkelen banen. Undersøkelse av de permeabilization egenskapene til APGD-t fortsatte og i kontrollstudier ble det funnet at bæreren inert gasstråle av plasma uten magnetisering var også i stand til å permeabilize celler. Dette motsies den første hypotesen om at de reaktive skapt av plasma jet midlertidig svekket membranen funksjon og foreslo at bare de mekaniskecal styrker var tilstrekkelig til å forårsake celle permeabilization. Herfra studier fortsatte i vår lab for å prøve og kvantifisere og karakterisere permeabilization effektiviteten av en inert gass jet samt se på sine transfeksjon evner ^16.

Ved disse studier har man funnet at mikroporer gjør faktisk form i plasmamembranen, og disse porer har en tendens til å forsegle innen ca 5 sek ^15. Vi har vist at teknikken er verktøyet in vitro og in vivo i chorioallantoic membran av en chick embryo.

Protocol

En. Utvikling av LabView Program En massestrømningsregulatoren (MKS M100B Mass-Flo Controller) er festet til heliumgassledningen for å sikre en nøyaktig gass-strømningshastighet. Denne enheten styres av en inngangsspenning, som varierer mellom 0 og 5 V. En styresløyfe i LabView programmet bestemmer den nødvendige spenning til enhver tid. Grensesnitt mellom datamaskinen og massestrømningsregulatoren er utført av en datainnsamlingsanordning (NI USB-6009), og en 12 V forsyningen gir strøm til massestrø…

Representative Results

Permeabilization av HeLa-celler med 10 kDa grønt fluorescerende dextran ved hjelp av en heliumgasstråle med et 0,86 mm indre diameter kapillær er vist i figur 1.. Celler ble kontra umiddelbart etter permeabilization med 2 mL / ml EthD-ett-løsning (LIVE / DEAD Livskraftig / Cytotoksisitet Kit) for å visualisere celledød. Umiddelbart etter kontra, ble dekkglass montert og avbildes. Denne figuren viser resultatet av å drive heliumgass jet ved tre forskjellige utløpstrykk, sammenlignet med en kontro…

Discussion

Inert gasstråle permeabilization er en nyttig teknikk for vedheftende celle transfeksjon. Den gir mulighet til å overføre biomolekyler inn i celler ved bruk av mekaniske krefter, noe som eliminerer behovet for potensielt skadelige kjemikalier eller virale vektorer. Teknikken kan potensielt gi forskere og klinikere en effektiv og relativt enkel måte å nøyaktig transfektere celler. Selektiviteten av permeabilization er også unik slik at forskere bare behandle visse celler i en enkelt koloni som kan være nyttig i m…

Materials

Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells
Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable	Life Technologies Inc.	D22910	dextran for permeabilization experiments
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	for counterstaining of mammalian cells
Prolong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930	for mounting slides when imaging
Ultra High Purity Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	for HeLa cells
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	26140079	For DMEM media
Penicillin-Streptomycin, liquid	Invitrogen	15140-122	For DMEM media
Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x			Produced in lab
			Table 1. List of required reagents
6-Well Clear TC-Treated Microplates	Corning	3506
#1 22 x 22 Coverslips	Fisher	12-542B
Glass Capillaries	World Precision Instruments		WPI Sizing Information
ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Mass-Flo Controller	MKS	M100B01314CS1BV	Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply
USB-6009 DAQ Device	National Instruments	779026-01
UniSlide Assembly with stepping motor and controller	Velmex		Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller
			Table 2. List of required equipment