Permeabilización de células adheridas Usando un gas inerte Jet
Summary
Este protocolo describe un método para la permeabilización temporal de células adherentes utilizando un chorro de gas inerte. Esta técnica facilita la transferencia de material genético y biomoléculas en células de mamífero adherentes por la utilización de fuerzas mecánicas para romper la membrana de plasma.
Abstract
Existen diversas técnicas de transfección de células y éstas se pueden dividir tres grandes categorías: viral, químicas y mecánicas. Este protocolo describe un método mecánico para permeabilizar temporalmente las células adherentes utilizando un chorro de gas inerte que puede facilitar la transferencia de macromoléculas normalmente no permeables a las células. Creemos que esta técnica funciona impartiendo fuerzas de cizallamiento en la membrana plasmática de las células adherentes, resultando en la formación temporal de microporos. Una vez que se crean estos poros, las células son entonces permeable al material genético y otras biomoléculas. Las fuerzas mecánicas que intervienen no corren el riesgo de dañar permanentemente las células o se separe de su sustrato. No es, por lo tanto, una estrecha gama de dinámica de gases inertes donde la técnica es eficaz. Un chorro de gas inerte se ha demostrado su eficacia en la permeabilización de diversas líneas de células adherentes, incluidos HeLa, HEK293 y células endoteliales de aorta abdominal humanos. Este protocolo es apropiado para el permeabilization de células adherentes, tanto in vitro y, como hemos demostrado, in vivo, demostrando que puede ser utilizado para la investigación y, potencialmente, en futuras aplicaciones clínicas. También tiene la ventaja de permeabilización de las células de una manera espacialmente restrictiva, lo que podría llegar a ser una valiosa herramienta de investigación.
Introduction
Con la evolución de la biomedicina y la comprensión de la mecánica de células, la entrega de las biomoléculas en células se ha convertido en vital para muchos campos de investigación y las terapias médicas. Diferentes técnicas han sido desarrollados para introducir moléculas extrañas a través de la membrana plasmática y en el citosol de la célula. Estos se pueden clasificar en general ya sea como: técnicas viral, químicos o mecánicos. Técnicas virales pueden transfectar material genético, tales como ARN y ADN utilizando vectores virales 1. Técnicas virales tienden a tener altos rendimientos en ciertas líneas celulares, sin embargo tienen la posibilidad de reacciones inmunes e inflamatorias 2. Métodos de transfección química comunes incluyen precipitación con fosfato de calcio 3, exotoxinas bacterianas 4 y 5 lipofección. Estas técnicas han demostrado ser eficaces, sin embargo, ciertos problemas surgen tales como toxicidad celular y no especificidad. Además, las técnicas tales como Phosphat de calcioe precipitación se han encontrado para tener eficiencias de transfección de hasta 70%, pero sólo en ciertas líneas celulares, rara vez en las células primarias 6. Esto es de nota como el aumento de los esfuerzos de investigación se están poniendo en células primarias, especialmente en el caso de diseñar diversos tratamientos para el uso clínico y el estudio de funcionamiento de ADN.
La interrupción temporal de la membrana celular a través de estímulos mecánica es una alternativa para la introducción de moléculas extrañas en las células. Las técnicas incluyen: la microinyección de moléculas 7, electroporación usando un campo eléctrico para romper la membrana 8,9, sonoporación utilizando ondas de ultrasonido para romper la membrana celular 10-12, bombardeo de partículas como se demuestra por la "pistola de genes", que dispara partículas unidas con genes en la célula 13, y, más recientemente, la aplicación de la tensión de cizallamiento de fluido que se ha demostrado para permeabilizar temporalmente las células de mamífero 14,15. Aunque mecánicométodos cols evitar algunos de los problemas antes mencionados, por lo general son acompañados por una menor eficiencia y configuraciones muy complejas y especializadas. Una antorcha de descarga luminiscente a presión atmosférica (APGD-t) fue desarrollado en McGill con el objetivo inicial de la funcionalización de superficies y separar las células adherentes in vitro 16. Casualmente, se descubrió que una mancha en vivo / muerto se está utilizando de alguna manera se está tomada en por las células sin que se añade un agente de permeabilización. Además, este parecía haber ocurrido sólo en áreas restringidas de los pozos que sucedieron para que coincida con la ruta de la antorcha. Investigación de las capacidades de permeabilización de la APGD-t continuó y en los estudios de control, se encontró que el chorro de gas inerte portador del plasma sin excitación también fue capaz de permeabilizar las células. Esto contradecía la hipótesis inicial de que las especies reactivas creadas por el chorro de plasma alterado de forma temporal la función de la membrana, y sugirió que simplemente los mecánicosfuerzas de cal fueron suficientes para causar la permeabilización celular. A partir de aquí, se continuaron los estudios en nuestro laboratorio para tratar de cuantificar y caracterizar la eficiencia de la permeabilización de un chorro de gas inerte, así como cuidar a sus capacidades de transfección 16.
A través de estos estudios, se ha encontrado que los microporos se puede hacer en forma de hecho en la membrana plasmática, y estos poros tienden a cerrar de nuevo dentro de aproximadamente 5 seg 15. Hemos demostrado la utilidad de la técnica in vitro e in vivo en la membrana corioalantoidea de un embrión de pollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Permeabilización chorro de gas inerte es una técnica útil para la transfección de células adherentes. Se proporciona la capacidad de transferir biomoléculas en células con el uso de fuerzas mecánicas, lo que elimina la necesidad de productos químicos potencialmente dañinos o vectores virales. La técnica podría potencialmente dar a los investigadores y los clínicos de una manera eficiente y relativamente sencillo para transfectar células con precisión. La selectividad de la permeabilización también es ú…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiación: Canadiense Institutos de Investigación en Salud (CIHR), las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Riferimenti
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