Permeabilization vidhäftat celler med en Inert Gas Jet
Summary
Detta protokoll beskriver ett förfarande för temporär permeabilisering av vidhäftande celler med hjälp av en inert gasstråle. Denna teknik underlättar överföringen av genetiskt material och biomolekyler i adherenta däggdjursceller genom användning av mekaniska krafter för att störa plasmamembranet.
Abstract
Olika cell transfektionstekniker finns och dessa kan brytas ner till tre breda kategorier: virus, kemiska och mekaniska. Detta protokoll beskriver en mekanisk metod för att tidsmässigt permeabilisering vidhäftande cellerna med användning av en inert gasstråle som kan underlätta överföringen av normalt icke-permeabla makromolekyler in i celler. Vi tror att den här tekniken fungerar genom att åstadkomma skjuvkrafter på plasmamembranet av vidhäftande celler, vilket resulterar i tillfällig bildning av mikroporer. När dessa porer skapas är cellerna sedan permeabla för genetiskt material och andra biomolekyler. De mekaniska krafter som är involverade inte riskerar att permanent skada eller lossnar cellerna från deras substrat. Det finns därför ett snävt intervall av inerta gasdynamik där tekniken är effektiv. En inert gas jet har visat sig effektiva på permeabilisering olika fastsittande cellinjer inklusive HeLa, HEK293 och mänskliga buken aorta endotelceller. Detta protokoll är lämpligt för den permeabilization av vidhäftande celler både in vitro och, som vi har visat, in vivo, visande den får användas till forskning och eventuellt i framtida kliniska applikationer. Det har också fördelen av permeabilisering celler i ett rumsligt restriktivt, vilket kan visa sig vara ett värdefullt forskningsverktyg.
Introduction
Med utvecklingen av biomedicin och förståelsen av cellmekanik, har leveransen av biomolekyler till celler blir avgörande för många forskningsområden och medicinska behandlingar. Olika tekniker har utvecklats för att införa främmande molekyler genom plasmamembranet och in i cellens cytosol. Dessa kan i allmänhet klassificeras som antingen: virus, kemiska eller mekaniska tekniker. Viral tekniker kan transfektera genetiskt material såsom RNA och DNA med hjälp av virala vektorer 1. Viral tekniker tenderar att ha en hög effektivitet i vissa cellinjer, men de har potential för immunologiska och inflammatoriska reaktioner 2. Vanliga kemiska transfektion metoder är utfällning med kalciumfosfat 3, bakteriella exotoxiner 4 och lipofektion 5. Dessa tekniker har visat sig vara effektiva, men det uppstår vissa problem, såsom celltoxicitet och icke-specificitet. Vidare tekniker såsom kalcium phosphate nederbörd har visat sig ha transfektionseffektiviteter upp till 70%, men endast i vissa cellinjer, sällan i primära celler 6. Detta är anmärknings som ökade forskningsinsatser sätts in i primära celler, särskilt när det gäller att utforma olika behandlingar för klinisk användning och studier av DNA-funktion.
Tidsmässig sönderdelning av cellmembranet genom mekanisk stimuli är ett alternativ för att införa främmande molekyler i celler. Tekniker inkluderar: mikroinjektion av molekyler 7, elektroporering med användning av ett elektriskt fält för att störa membranet 8,9, sonoporation använder ultraljudsvågor för att störa cellmembranet 10 till 12, partikelbombardemang, vilket framgår av den "gene gun", som skjuter partiklar bundna med gener i cellen 13, och mer nyligen, tillämpningen av vätska skjuvspänningen som har visat sig tidsmässigt permeabilisera däggdjursceller 14,15. Även mekanikeral metoder undvika några av de ovannämnda frågorna, de är oftast åtföljs av lägre effektivitet och mycket komplicerade och specialiserade inställningar. Ett lufttryck glimurladdning brännare (APGD-t) utvecklades vid McGill med det ursprungliga målet för functionalizing ytor och lösgöra vidhäftande celler in vitro 16. Serendipitously, upptäcktes det att en levande / död fläck som används på något sätt tas in av celler utan en permeabilisering medel som läggs till. Dessutom verkade det ha skett endast i begränsade områden i brunnarna som hänt för att matcha upp med facklan vägen. Utredning permeabilization kapacitet APGD-t fortsatt och i kontrollstudier, visade det sig att bäraren inert gas stråle av plasma utan excitation kunde också permeabilize celler. Detta motsade den inledande hypotesen att de reaktiva ämnen som skapas av plasmastråle försämras tillfälligt membranfunktion och föreslog att bara de mekaniskatiska styrkor var tillräcklig för att orsaka cell permeabilization. Härifrån, studier fortsatte i vårt labb för att försöka kvantifiera och karakterisera permeabilization effektiviteten av en inert gas jet samt titta på dess transfektion kapacitet 16.
Genom dessa studier har det visat sig att mikroporerna i själva verket formen i plasmamembranet, och dessa porer tenderar att återförsluta inom ca 5 sek 15. Vi har visat att tekniken användbarhet in vitro och in vivo i korioallantoismembranet i ett kycklingembryo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inert gas jet permeabilization är en användbar teknik för vidhäftande cell transfektion. Det ger möjlighet att överföra biomolekyler i celler med hjälp av mekaniska krafter, vilket eliminerar behovet av potentiellt skadliga kemikalier eller virala vektorer. Tekniken skulle kunna ge forskare och kliniker ett effektivt och relativt enkelt sätt att exakt transfektera celler. Selektivitet permeabilization är också unikt att låta forskare endast behandla vissa celler i en enda koloni som kan vara användbart i fl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka följande finansieringskällor: Canadian Institutes of Health Research (CIHR), naturvetenskaplig och teknisk forskning Council (NSERC).
Materials
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media – 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
Riferimenti
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans–immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
