בקרה כמותי וזמנית של Microenvironment חמצן ברמה יחיד Islet
Summary
Microfluidic oxygen control confers more than just convenience and speed over hypoxic chambers for biological experiments. Especially when implemented via diffusion through a membrane, microfluidic oxygen can provide simultaneous liquid and gas phase modulations at the microscale-level. This technique enables dynamic multi-parametric experiments critical for studying islet pathophysiology.
Abstract
חמצון וניטור סימולטני של גורמי צימוד גירוי הפרשת גלוקוז בטכניקה אחת הוא קריטי לדוגמנות מדינות pathophysiological של היפוקסיה איון, במיוחד בסביבות השתלה. טכניקות קאמריות חוסר חמצן רגילים לא יכולות לווסת את שני הגירויים באותו הזמן ולא מספקות ניטור של גורמי צימוד גירוי הפרשת גלוקוז בזמן אמת. כדי לתת מענה לקשיים אלה, אנחנו מוחלים טכניקת microfluidic רב שכבתית לשלב גם מימיים ומודולציות שלב גז דרך קרום דיפוזיה. זה יוצר כריך גירוי סביב איי microscaled בתוך polydimethylsiloxane השקופה המכשיר (PDMS), המאפשר ניטור של גורמי הצימוד האמורים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, קלט הגז נשלט על ידי זוג microdispensers, מתן מודולציות של חמצן בין 0-21% כמותית, משנה דקה. היפוקסיה לסירוגין זה מיושמת לחקור תופעה חדשה של אינפשית מראש לא. יתר על כן, חמוש במיקרוסקופ מולטי, היינו יכול להסתכל על סידן מפורט ודינמיקת ערוץ K-ATP במהלך אירועי חוסר חמצן אלה. אנחנו מדמיינים היפוקסיה microfluidic, במיוחד טכניקת שלב הכפול בו זמנית זו, ככלי רב ערך בלימוד האיים, כמו גם רקמות רבות vivo לשעבר.
Introduction
היפוקסיה דינמית חשובה בביולוגיה, במיוחד עבור השתלות איון
היפוקסיה דינמית היא פיסיולוגי חשוב, כמו גם פרמטר pathophysiological בהרבה רקמות ביולוגיות. שינוי בחמצן, לדוגמא, הוא אות התפתחותית חזקה באנגיוגנזה. יתר על כן, דפוסי מרחב ובזמן בהיפוקסיה לווסת HIF1-alpha וממלא תפקידים במחלות כמו סרטן לבלב. היפוקסיה היא גם גורם בלבול משפיע על תוצאות השתלת איון. לאחרונה, temporally תנודות של היפוקסיה, או היפוקסיה לסירוגין (IH) הוכיחו יתרונות באיונים "נפשית מראש" 1. עם זאת, השפעות היפוקסיה הן סטטי והחולפים על פיזיולוגיה איון עדיין לא הבינו היטב או למדו, בעיקר בשל העדר הכלים המתאימים לשלוט microenvironment של איון.
איים הם vascularized גם in vivo
איי לבלב הם 50-400 אגרגטים spheroidal מ 'של תאים האנדוקרינית, כוללים תאים בטא ואלפא תאים שאחראים על הומאוסטזיס הגלוקוז; 56. כאשר איונים נחשפים לגירוי גלוקוז בדם, הספיגה וגליקוליזה להוביל לייצור ATP, אשר פותח אשלגן ATP רגיש ערוצים (K-ATP) ותוצאות בזרימת סידן שמפעילה את exocytosis גרנולות אינסולין. החמצן הוא חשוב לנהוג תהליך חילוף חומרים בכבדות זה והפרשת אינסולין מושפעת באופן משמעותי על ידי הדינמיקה של זרימת דם ואספקת חמצן בנוסף לשיפועי גלוקוז. איונים בקלות לבצע תגובת גלוקוז אינסולין זה in vivo כפי שהם perfused ביותר בלבלב, כל אחד באורך תא אחד מכלי נימים. עם זאת, הרשת הצפופה של נימי דם intraislet הוסרה על ידי collagenase במהלך 2,3 בידוד איון. כתוצאה מכך, אספקת חמצן וחומרי מזון מוגבלות להיקף 100 מיקרומטר בשל מגבלות דיפוזיה.
הצלחה צעד "> טכניקות נוכחי מוגבלות ביצירה מחדש של microenvironment איוןהדינמיקה של איון מחדש האם של החמצן וגלוקוז, מפתח לדוגמנות תנאים פיסיולוגיים וpathophysiological, קשה להשיג עם תאי חוסר חמצן סטנדרטיים הדורשים זרימה משוכללת וחוסר ניטור רציף של פונקציות איון. יתר על כן, טיפולי השתלה לסכרת מסוג לחשוף איים מבודדים להיפוקסיה במערכת השער הכבד 4 שבו יש הרבה יותר נמוך ת.ד. 2 (<2%, 5-15 מ"מ כספית) בהשוואה ללבלב פיסיולוגי (5.6%, 40 מ"מ כספית). לאחר השתלה, שתלי איון לקחת שבועיים או יותר כדי להיות revascularized. הוכח כי חשיפת חוסר חמצן פוגעת במנגנון צימוד גלוקוז האינסולין של איון. בין גורמי צימוד גירוי הפרשה, סידן איתות, פוטנציאל של המיטוכונדריה, ואינסולין קינטיקה יכולה להיות בקלות לנטר באמצעות מיקרופלואידיקה. טכניקת microfluidic הקודמת שלנו הוכיחה מחדש את זהאל זמן ניטור עם אפנון מדויק של microenvironment המימית סביב איון בודד 5,6. עם זאת, כימות של ליקוי חוסר חמצן של איון היא מתוסכלת מחוסר טכניקות גירוי וניטור בו זמנית. לכן, שילוב של שליטת microfluidic של חמצן וניטור איון יכול לשפר מחקרי היפוקסיה איון.
מיקרופלואידיקה יכול לשחזר ולווסת את microenvironment המימית וחמצן
הטכניקה סטנדרטית ללימודי רקמה והיפוקסיה התרבות הייתה מבוססת על תאי חוסר חמצן. באופן כללי, תאי חוסר חמצן מספקים ריכוזי חמצן יחיד עם זמני איזון ב~ 10-30 דקות, עולים בקנה אחד עם היפוקסיה הדינמית בקנה מידת דקה. שני מחקרים שנעשה לאחרונה בשימוש תאים מותאמים אישית קטנים לחשיפת היפוקסיה לסירוגין על כל עכברים, עם תוצאות סותרות בתגובה לאינסולין-Induced גלוקוז 7,8. יש לזכור כי ברמת החיה שלמה, חמצן respired הוא לא ישירות טראןאמור איון הנימים ת.ד. 2, בשל בקרות במערכת הנשימה. יתר על כן, אין לי מחקרים אלו רמות חמצן סטנדרטיות, ולא שהם מספקים אמצעים בזמן אמת ברמת הרקמה של איים.
מצד השני, מיקרופלואידיקה חמצן יכול לעלות על המגבלות האלה על ידי השליטה חמצן באמצעות רשתות ערוץ גז. יתר על כן, מיקרופלואידיקה תואם הדמיה לחיות באפנון חמצן, הישג כרגע לא אפשרי עם תאי חוסר חמצן רגילים. מספר מיקרופלואידיקה אלה הרומן מתקרב לנצל את חדירות הגז של polydimethylsiloxane לפזר ריכוזי חמצן לתוך microchannels שזורמות תקשורת על תאי יעד 9-14. גם מכשירים אלה משולבים ריכוזים מרובים בדידים חמצן, חיישני חמצן הקרינה מבוססת, ואפילו דור חמצן כימי על שבב.
יש לי מיקרופלואידיקה מבוסס solvation נוזלי יתקשה להחזיק הדרגתיים יציב, רציף כמו שאנילא תלוי בערבוב הסעה שהיא רגישה לתנאי זרימה. לשם השוואה, הטכניקה שאנו משתמשים כאן מתמקדת בהפחתת נתיב דיפוזיה של אספקת חמצן. Solvation הגז וזרימת גזירה בוטלו על ידי ישירות לשדר חמצן על פני קרום שנזרע עם תאים או רקמות איון. פעולה זו מסירה את מיקרופלואידיקה הנוסף הנדרש כדי לשלוט solvation ומונעת לחץ גזירה מיותר לאיים, שעצמו יכול לעורר שחרור אינסולין. פלטפורמה זו נעשתה שימוש כדי להדגים מיני חמצן תגובתי (ROS) עד ויסות בקצות שני hyperoxic וחוסר חמצן (2-97% O 2) בתא התרבות 1,15. בגלל המשלוח הישיר של חמצן ופינוי של זרימת גזירה, הפלטפורמה הבוסס על דיפוזיה שלנו מספקת את הפתרון האופטימלי לחקר microfluidic היפוקסיה איון.
גירוי וניטור multimodal
מיקרופלואידיקה מבוסס דיפוזיה גם מביא יתרונות נוספים כאשר מותאם ללימוד מיל איוןcrophysiology. באמצעות קרום כמחסום דיפוזיה, הנוזל יכול להיות מבודד ממודולציות החמצן, מה שמאפשר בקרה של גירויים גלוקוז מימיים באופן עצמאי מגירויי חוסר חמצן. זה יוצר גירוי בו זמנית כמו כריך שמרחבית משלוח פיני נקודות לאיים. יתר על כן, כפי שהגז הוא מווסת temporally דרך microinjectors הממוחשב, אנו יכולים לווסת את ריכוז החמצן 21-0% דיגיטלי עם זמן חולף פחות מ60 שניות. הבקרות דינמיות של החמצן וגלוקוז microenvironment במיקרוסקופ מאפשרות פרוטוקול מולטי זמן אמת זה יהיה אפשרי או בלתי רגיל מסורבל לא באמצעות תאי חוסר חמצן רגילים. שימוש במכשיר זה, סידן איתות (פורע-AM), פוטנציאל של המיטוכונדריה (Rhodamine 123), וקינטיקה אינסולין (ELISA) היו במעקב כדי לספק תמונה של תגובת הגלוקוז האינסולין הדינמית תחת היפוקסיה מלאה.
Protocol
Representative Results
Discussion
The multiple modalities integrated in this islet hypoxia technique present several points noted here for troubleshooting. First the isolated islets continue to degrade and disintegrate in culture due to digestive enzymes from acinar cells. Standardizing experiments to 1-2 days after islet isolation is thus critical in obtaining consistent results. Second, the aqueous flow was stopped during hypoxia and intermittent hypoxia to prevent convective clearance at the boundary between laminar flow and diffusion. This seems to l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institutes of Health Grants R01 DK091526 (JO), NSF 0852416(DTE), and Chicago Diabetes Project.
Materials
| Reagent/Material | |||
| Spinner | Laurell | WS-400 | |
| SU8 | MicroChem | SU8-2150/SU8-2100 | |
| Digital Hotplate | PMC Dataplate | 722A | |
| UV Curing Lamp | OmniCure | S1000 | |
| PMDS | Dow Chemical | Sylgard 184 | |
| Corona Wand | ETP | BD-20AC | |
| Vacuum Chamber | Bel-Art | 420220000 | |
| Microdispensers | The Lee Company | IKTX0322000A | |
| 5 V and 20 V DC Power | Radio Shack | ||
| NI USB | National Instrument | NI USB-6501 | |
| Thermometer | Omega Engineering, Inc. | ||
| Peristaltic Pump | Gilson | Minipulse 2 | |
| Oxygen Sensor | Ocean Optics | NeoFox | |
| Fraction Collector | Gilson | 203 | |
| Pippette | Fisher Scientific | Finnpipette II 100μl | |
| Inverted Epifluorescence Microscope | Leica | DMI 4000B | |
| 50 ml Conical Tubes | Fisher Scientific | ||
| Fura-2 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Rhodamine 123 Fluorescence Dye | Molecular Probes, Life Technologies | ||
| Culture Media | Sigma-Aldrich | RPMI-1640 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| 30 in Silicone Tubings | Cole-Parmer | 1/16 in x 1/8 in | |
| 1.5 ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | ||
| Y-connectors | Cole-Parmer | 1/16 in and 4 mm | |
| Syringe Connectors | Cole-Parmer | female Luer plug 1/16 in | |
| Straight Connectors | Cole-Parmer | 1/16 in | |
| Elbow Connector | Cole-Parmer | 1/16 in |
Riferimenti
- Lo, J. F., Wang, Y., et al. Islet Preconditioning via Multimodal Microfluidic Modulation of Intermittent Hypoxia. Anal. Chem. 84 (4), 1987-1993 (2012).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp.. , e1125 (2009).
- Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets. J. Vis. Exp.. , e1343 (2009).
- Shapiro, A. M., et al. Islet Transplantation in Seven Patients with Type 1 Diabetes Mellitus Using a Glucocorticoid-Free Immunosuppressive Regimen. N. Engl. J. Med. 343 (4), 230-238 (2000).
- Adewola, A. F., Wang, Y., Harvat, T., Eddington, D. T., Lee, D., Oberholzer, J. A Multi-Parametric Islet Perifusion System within a Microfluidic Perifusion Device. J. Vis. Exp.. , e1649 (2010).
- Mohammed, J. S., Wang, Y., Harvat, T. A., Oberholzer, J., Eddington, D. T. Microfluidic device for multimodal characterization of pancreatic islets. Lab Chip. 9, 97-106 (2009).
- Carreras, A., Kayali, F., Zhang, J., Hirotsu, C., Wang, Y., Gozal, D. Metabolic Effects Of Intermittent Hypoxia In Mice: Steady Versus High Frequency Applied Hypoxia Daily During The Rest Period. AJP – Regu Physiol. 303 (7), 700-709 (2012).
- Lee, E. J., et al. Time-dependent changes in glucose and insulin regulation during intermittent hypoxia and continuous hypoxia. Eur. J. Appl. Physiol. , (2012).
- Kane, B. J., Zinner, M. J., Yarmush, M. L., Toner, M. Liver-specific functional studies in a microfluidic array of primary mammalian hepatocytes. Anal. Chem. 78, 4291-4298 (2006).
- Lam, R. H. W., Kim, M. C., Thorsen, T. Culturing aerobic and anaerobic bacteria and mammalian cells with a microfluidic differential oxygenator. Anal. Chem. 81, 5918-5924 (2009).
- Polinkovsky, M., Gutierrez, E., Levchenko, A., Groisman, A. Fine temporal control of the medium gas content and acidity and on-chip generation of series of oxygen concentrations for cell cultures. Lab Chip. 9, 1073-1084 (2009).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomed. Microdev. 9 (2), 123-134 (2007).
- Vollmer, A. P., Probstein, R. F., Gilbert, R., Thorsen, T. Development of an integrated microfluidic platform for dynamic oxygen sensing and delivery in a flowing medium. Lab Chip. 5, 1059-1066 (2005).
- Chen, Y., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11, 3626-3633 (2011).
- Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10, 2394-2401 (2010).
