Alimentação dos Carrapatos em Animais de Transmissão e Xenodiagnóstico em Lyme Disease Research

Summary

A doença de Lyme é a doença mais comumente relatados transmitidas por vetores na América do Norte. O agente causador, a Borrelia burgdorferi é uma bactéria espiroqueta transmitida por carrapatos ixodídeos. A transmissão e a detecção de infecção em modelos animais é optimizada pela utilização de alimentação de carraça, que aqui descrita.

Abstract

A transmissão do agente etiológico da doença de Lyme, Borrelia burgdorferi, ocorre pelo apego e alimentarem de sangue de espécies Ixodes carrapatos em hospedeiros mamíferos. Na natureza, este patógeno bacteriano zoonótica pode usar uma variedade de hospedeiros, mas o rato branco de pés (Peromyscus leucopus) é o reservatório primário para carrapatos larva e ninfa na América do Norte. Os seres humanos são hospedeiros acidentais mais frequentemente infectados com B. burgdorferi pela picada de carrapatos na fase de ninfa. B. burgdorferi se adapta a seus hospedeiros ao longo do ciclo enzoótica, portanto a capacidade de explorar as funções destes espiroquetas e seus efeitos em hospedeiros mamíferos requer o uso de alimentação do carrapato. Além disso, a técnica de xenodiagnóstico (utilizando o vector natural para a detecção e a recuperação de um agente infeccioso) tem sido útil em estudos de infecção críptica. Para a obtenção de ninfas carrapatos que porto B. burgdorferi,carrapatos são alimentados espiroquetas vivas em cultura por meio de tubos capilares. Dois modelos animais, ratos e primatas não-humanos, são mais comumente usados ​​para estudos de doença de Lyme que envolvem a alimentação do carrapato. Demonstramos os métodos pelos quais esses carrapatos podem ser alimentados em cima, e recuperados a partir de animais para ou infecção ou xenodiagnóstico.

Introduction

Em 2011, a doença de Lyme foi a doença mais comum Nacionalmente Notificável 6 na América do Norte ( http://www.cdc.gov/lyme/stats/index.html ). B. burgdorferi é um micróbio versátil, tanto geneticamente e antigenicamente (revisto em ^1). Sua constituição genética inclui um grande (> 900 kB) cromossomo e até 21 plasmídeos (12 lineares, 9 circulares), com conteúdo plasmídeo variando entre os isolados. Muito está a ser aprendido sobre este espiroquetas, como mais de 90% dos plasmídeos de leitura aberta quadros são alheios a quaisquer conhecidas seqüências bacterianas ^2,3. B. burgdorferi apresenta uma grande variedade de antigénios, como alvos potenciais de imunidade do hospedeiro. No entanto, a infecção não tratada muitas vezes persistir. A interação de espiroquetas com o meio ambiente e carrapato hospedeiro vertebrado exige uma adaptação por B. burgdorferi em todo o processo de infecção. Vários plasmídeo codificadogenes são conhecidos por serem expressos diferencialmente em resposta a mudanças de temperatura, pH, densidade celular e mesmo estágio do ciclo de vida do carrapato ^4-8.

O estudo da B. burgdorferi adaptação durante todo o seu ciclo de enzoótica, e as respostas do hospedeiro após a infecção por via natural, baseia-se na capacidade de alimentar carrapatos em modelos animais apropriados. Tais estudos estão satisfeitos com os desafios técnicos de geração de carrapatos que abrigam B. burgdorferi, e garantir a transmissão eficiente e / ou alimentação de carrapatos no host modelo. Além disso, a retenção e a recuperação de carraças infectadas é essencial. Entre os modelos utilizados são ratos e primatas não-humanos, cada um dos quais serve como uma ferramenta valiosa para a pesquisa da doença de Lyme. Tal como acontece com o rato branco de pés, o que é um hospedeiro natural para B. burgdorferi, o rato de laboratório é uma série altamente suscetíveis que suporta a infecção persistente por B. burgdorferi ^9. Folguinte a infecção de ratinhos susceptíveis a doenças, tais como a estirpe C3H, os espiroquetas difundir para vários tecidos, incluindo a pele, bexiga, músculos, articulações e coração. As respostas inflamatórias à infecção levar a coração doente e articulações. Enquanto as espiroquetas persistir nesse hospedeiro e permanecem infecciosos, lesões inflamatórias, pode tornar-se intermitente, ao contrário do processo em seres humanos. O modelo do rato tem, assim, fornecido muita informação sobre B. patologia induzida por burgdorferi, incluindo artrite e cardite e resposta imune do hospedeiro ^10-12. Do ponto de vista do agente patogénico, certos genes diferencialmente expressos durante a infecção de mamíferos têm sido caracterizados, como ter algum necessário para a transmissão a partir do vector carrapato ^13-21.

Apesar de várias espécies animais têm sido utilizados para estudar a doença de Lyme ²² macacos rhesus imitar mais de perto o caráter multi-órgão da doença humana ^23. Ao contrário de outrosmodelos animais, a amplitude das manifestações de doença, tais como eritema migrans, cardite, artrite e neuropatias dos sistemas nervosos periférico e central, observada em macacos. Em camundongos, o anfitrião reservatório para B. burgdorferi, a doença varia de acordo com a tensão do mouse e ²⁴ anos, enquanto que as manifestações precoces e tardias-divulgados são incomuns ^9. Além disso, outros roedores, lagomorfos, e caninos tudo não exibem doença neurológica de B. infecção burgdorferi ^25. É importante ressaltar que os macacos apresentam sinais que são característicos de todas as três fases da borreliose de Lyme, ou seja, no início localizada, early-divulgada, e fase final de doença de Lyme ^26-28. Eritema migrans (EM), pensa-se que ocorre em 70-80% dos casos humanos ^29, e é também observada em macacos rhesus ^28,30. Após a infecção, as espiroquetas difundir a partir do local de inoculação de vários órgãos. ADN Espiroquetal foi detectada em mu esqueléticoscles, coração, bexiga, sistema nervoso periférico e do plexo, bem como no sistema nervoso central (cérebro, tronco cerebral e cerebelo, espinal medula, e dura-máter) ^31.

Assinale alimentando-se de ratos tem sido utilizada por nós e por outros grupos de pesquisa para a propagação de colônias de carrapatos, em competência reservatório estuda ^32-36 e em estudos de B. burgdorferi patogênese ^37-40. Esta técnica também foi usada para xenodiagnóstico e testes de eficácia da vacina em ratinhos ^41-44. Temos alimentado Ixodes carrapatos em primatas não-humanos para o desenvolvimento de modelo de ²⁸ anos, um estudo sobre a eficácia da vacina ^{de 45 anos,} e por xenodiagnóstico na avaliação da persistência do tratamento pós-antibiótico ^46. Carrapatos que porto B. burgdorferi podem ser mantidos em um ciclo natural, por enzoótica alimentando larvas em ratinhos infectados e usando as ninfas de estudos, como as espiroquetas são transmitidos através das etapas da vida. Neste relatório, Instruímos sobre como gerar os carrapatos infectados com o tipo selvagem ou mutante B. burgdorferi, usando capilar tubo de alimentação. Isto também pode ser realizada por micro-injecção ⁴⁷ e por imersão ^48. A finalidade da introdução artificial de B. burgdorferi em carraças podem ser estudar estirpes mutantes cuja transmissibilidade é desconhecido, para gerar um grupo de carraças com uma alta taxa de infecção, e para reduzir a possibilidade de erros através da manutenção de uma colónia carrapato limpo e de outra forma não infectado. Além disso, demonstramos alimentação carrapato em ratos e primatas não-humanos, de modo a assegurar a contenção e recuperação de carrapatos repletos. O uso de alimentação carrapato é essencial para futuros estudos de respostas imunes a B. infecção burgdorferi, o potencial de eficácia da vacina Lyme, e xenodiagnóstico para detecção de infecções ocultas.

Protocol

Um esboço experimental de inoculação carrapato e alimentação aos animais para a pesquisa da doença de Lyme é mostrada na Figura 1. 1. Inoculando ninfas Ixodes Carrapatos com B. burgdorferi Usando Tubo Capilar-feeding Ao realizar manipulações com carrapatos, jaleco branco com mangas elásticas, luvas e bonés bouffant descartáveis ​​são usados. A nossa técnica é uma versão modificada do que relatado p…

Representative Results

Após a conclusão da alimentação capilar, as carraças são normalmente repousou a 23 ° C durante 2-3 semanas, antes de serem alimentados com animais para a transmissão. Usando a técnica capilar-alimentação, descobrimos que mais de 90% de que o Fed carrapatos porto B. burgdorferi. A percentagem de carrapatos positivas é determinada por lavagem carrapatos em peróxido e de etanol, em seguida, esmagando-as em PBS estéril com um pilão em forma de tubo de microcentrífuga. O conteúdo do intestino médio…

Discussion

A fim de obter as carraças que porto B. burgdorferi para estudos a jusante, os carrapatos podem ser: (1) alimentados em camundongos infectados na fase de larva, (2) imersa em B. culturas burgdorferi, quer no estágio larval ou ninfal ^48; (3) microinjeção com B. burgdorferi ^47, ou (4) do tubo capilar alimentados B. burgdorferi ^49. Enquanto cada um destes métodos tem a sua finalidade, para garantir que uma grande parte dos carrapatos a ser u…

Materials

			Reagent
BSK-H	Sigma	B-8291
Ketamine HCl
Tangle Trap coating Paste	Ladd research	T-131
SkinPrep	Allegro Medical Supplies	177364
LeFlap, 3″ x 3″	Monarch Labs
Hypafix tape	Allegro Medical Supplies	191523
SkinBond	Allegro Medical Supplies	554536
UniSolve	Allegro Medical Supplies	176640
Biatane Foam, adhesive 4″x4″	Coloplast	3420
DuoDerm CGF Dressing – 4″ x 4″, (3/4)” adhesive border	Convatec	187971
Nonhuman primate jackets with flexible 2″ back panels; add drawstrings at top and bottom	Lomir Biomedical Inc.
			EQUIPMENT
Pipet puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Dark field microscope	Leitz Wetzlar	Dialux
Dissecting microscope	Leica	Zoom 2000
Mouse caging	Allentown caging