Moteur section du nerf et imagerie time-lapse de comportements de cellules gliales chez le poisson zèbre en direct
Summary
Bien que le système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes après une blessure, on en sait peu sur les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. L'utilisation en direct, le poisson-zèbre transgénique et un essai de section du nerf reproductible, nous pouvons étudier les comportements des cellules gliales dynamiques au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération.
Abstract
Le système nerveux est souvent décrite comme une composante câblé du corps, même si elle est un système d'organe considérablement fluide qui réagit à des stimuli externes, d'une manière stéréotypée cohérente, tout en conservant une incroyable souplesse et la plasticité. Contrairement au système nerveux central (SNC), du système nerveux périphérique (SNP) est capable de réparations importantes, mais nous avons à peine commencé à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ce phénomène. En utilisant le poisson zèbre comme un système modèle, nous avons l'occasion sans précédent d'études régénératrices conjoints avec l'imagerie in vivo et les manipulations génétiques. Les nerfs périphériques sont constitués d'axones entourés par des couches de cellules gliales et du tissu conjonctif. Les axones sont ensheathed par myélinisants ou non-myélinisation des cellules de Schwann, qui sont à leur tour enveloppé dans un fascicule d'une gaine cellulaire appelée la perineurium. Suite à une blessure, les nerfs périphériques adultes ont la capacité remarquable à remove endommagé débris axonale et les objectifs re-innervent. Afin d'étudier le rôle des cellules gliales tout périphérique dans PNS régénération, nous décrivons ici un essai de dissection transversale de l'axone qui utilise un laser à colorant pompé l'azote disponible dans le commerce à axotomize nerfs moteurs chez le poisson zèbre transgénique en direct. Nous décrivons plus loin les méthodes de coupler ces expériences à l'imagerie time-lapse de nerfs blessés et de contrôle. Ce paradigme expérimental peut être utilisé non seulement pour évaluer le rôle que jouent les cellules gliales dans la régénération des nerfs, mais peut aussi être la plate-forme pour élucider les mécanismes moléculaires qui régissent la réparation du système nerveux.
Introduction
Le poisson zèbre ont été largement utilisées pour étudier le développement du système nerveux en raison de leur transparence optique et la facilité de la transgénèse, qui, lorsqu'il est couplé, pour permettre l'imagerie spectaculaire des comportements cellulaires dynamiques dans un embryon vivant. En outre, parce que le poisson-zèbre et les mammifères partagent presque tous les gènes nécessaires à la formation du système nerveux, l'information cellulaire et moléculaire collectées dans cet organisme modèle est directement rattachables à d'autres espèces de vertébrés. Même si incroyablement puissant pour les études du développement neural, le poisson zèbre et ses attributs uniques ont le potentiel pour élucider aussi les mécanismes qui maintiennent et reconstruire le système nerveux après une blessure. Les larves de poisson zèbre maintenir leur translucidité dans les stades larvaires fin et la pigmentation peut être effectivement bloqué soit avec l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques de la production de mélanine ou des mutants génétiques qui manquent cellules pigmentaires. Ainsi, en utilisant cet organisme modèle pour étudier les blessures et Regeneration chez les animaux âgés est possible et offre l'opportunité unique d'étudier directement les mécanismes cellulaires et moléculaires qui reconstruire le système nerveux. Dans ce manuscrit, nous décrivons comment blesser de manière efficace et reproductible nerfs dans les PNS de larves de poisson zèbre. Ce paradigme de la blessure elle-même prête à étudier non seulement la dégénérescence, mais aussi les réponses de la glie périphérique et les cellules immunitaires ainsi que les interactions entre ces populations au cours de la régénération.
Le PNS est un réseau complexe de nerfs moteurs et sensoriels qui est nécessaire pour transmettre des informations entre le système nerveux central (SNC) et la peau, les organes et les muscles du corps, permettant un organisme d'interagir avec son environnement et survivre. Le long de ces nerfs, la glie périphérique, y compris les cellules myélinisation et non myélinisants Schwann et gliales perineurial, ainsi que les tissus conjonctifs, enferment les axones et en définitive constituer le nerf mature. Blessure de ces nerfs initie un processus kurnommée Wallerian dégénérescence 10. Ce mécanisme de fragmentation axonale, le recrutement immunitaire, déblaiement des décombres et la régénération est très stéréotypé et génétiquement réglementé 1. Des études antérieures chez les mammifères ont décrit les rôles des cellules de Schwann au cours de la dégénérescence nerveuse et la régénération 1, 2, 6, 8. Dans ces études de tissu fixe ou culture de cellules, les cellules de Schwann non seulement recrutés macrophages au site de la lésion afin d'aider à déblaiement des décombres, mais aussi aidé à la myéline se phagocytose. Bien que ces études ont été incroyablement instructif, nous n'avons jamais avant réponses gliales visualisés à une lésion axonale périphérique in vivo en temps réel, et pas d'autres études ont examiné la relation entre les différentes classes de la glie périphérique lors de ces événements.
Récemment, plusieurs laboratoires ont étudié la dégénérescence Wallerian utilisant le poisson zèbre et les blessures de l'axone laser à médiation similaire à ce que nous décrivons ici <sup> 4, 5, 7, 9. Dans certaines de ces études, les axones sensoriels superficiels ont été axotomisés chez les jeunes larves en utilisant un custom built, à deux photons microscope confocal 4, 5, 9. Dans une autre étude, qui est très semblable à la nôtre, les axones les plus profondes au sein du nerf moteur ventral ont été recoupées dans des larves âgées de 5 jours en utilisant un système d'ablation laser disponibles dans le commerce 7. Dans ces deux expériences set-ups, l'accent était mis sur la dégénérescence Wallerian et les axones et les cellules immunitaires ont été imagées. Pour développer ces études, nous décrivons blessant axones moteurs dans les larves plus âgées avec plus matures, les nerfs myélinisés et analyse la réponse de tous les glie nerf périphérique associée au cours de la dégénérescence et de régénération.
Pour ce faire, nous transect nerfs moteurs à 6 et après la fécondation de 7 jours (DPF) de larves et de visualiser les réponses des populations gliales individuelles ainsi que d'enquêter sur les interactions entre ces populations le long des axones blessés. Utilisation double et triple tralignes nsgenic que la glie périphérique de l'étiquette, y compris les cellules de Schwann et gliales perineurial, ainsi que d'un marqueur pour les axones, nous utilisons un système d'ablation laser disponibles dans le commerce consistant en un atome d'azote pompé par laser à colorant (longueur d'onde 435 nm) attaché à un système confocal à disque rotatif pour créer transections axone. Cela permet expérimental de visualiser en direct, le poisson-zèbre larvaire, blesser voies axonales moteurs périphériques spécifiques et l'image time-lapse les réponses des populations gliales distinctes d'une blessure axonale et leur relation à l'autre. Ce protocole peut être plus adapté pour créer des blessures nerveuses chez le poisson zèbre d'âges différents, avec différentes lignées transgéniques ou des mutants génétiques pour aborder différentes questions scientifiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes les plus critiques de ce modèle expérimental sont: 1) les larves correctement le montage de blessure et après l'imagerie in vivo et 2) l'étalonnage du laser et de sélectionner les paramètres d'alimentation correctes afin de créer une section du nerf propre qui entraîne des dommages extra-tissulaire minimale . Pour aider à assurer un axotomy succès pour l'imagerie in vivo et l'analyse ultérieure, monter larves multiple soit dans des plats à fond de verre indiv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier le laboratoire Kucenas pour des discussions utiles et Quorum Technologies, Inc. pour un superbe support technique. Le travail a été financé par le Fonds UVa pour l'excellence en science et technologie (FEST) (SK).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629-100G |
| Finquel Tricaine Methanesulfonate MS-222 | Argent Chemical | C-FINQ-UE-100G |
| Low melting point agarose | Sigma | A9414-10G |
| Quad CELLview Cell Culture Dishes, Glass Bottom, Sterile, Greiner Bio One | VWR/Greiner | 89125-444 |
| Single well glass bottom Petri dishes 35 x 10 mm, 12 mm thick | Willco Wells | GWSt-3512 |
| MicroPoint Laser System with all components | Andor Technology – purchased through Quorum Technologies, Inc. | 2203-SYS |
| MicroPoint Laser Courmarin dye (435 nm) | Andor Technology | MP-27-435-DYE |
Riferimenti
- Geuna, S., et al. Chapter 3: Histology of the peripheral nerve and changes occurring during nerve regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 27-46 (2009).
- Hirata, K., Kawabuchi, M. Myelin phagocytosis by macrophages and nonmacrophages during Wallerian degeneration. Microsc. Res. Tech. 57, 541-547 (2002).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Martin, S. M., O’Brien, G. S., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Wallerian degeneration of zebrafish trigeminal axons in the skin is required for regeneration and developmental pruning. Development. 137, 3985-3994 (2010).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129 (2009).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143, 145-155 (2010).
- Rosenberg, A. F., Wolman, M. A., Franzini-Armstrong, C., Granato, M. In vivo nerve-macrophage interactions following peripheral nerve injury. J. Neurosci. 32, 3898-3909 (2012).
- Stoll, G., Muller, H. W. Nerve injury, axonal degeneration and neural regeneration: basic insights. Brain Pathol. 9, 313-325 (1999).
- Villegas, R., Martin, S. M., O’Donnell, K., Carrillo, S., Sagasti, A., Allende, M. L. Dynamics of degeneration and regeneration in developing zebrafish peripheral axons reveals a requirement for extrinsic cell types. Neural Development. 7, 19 (2012).
- Waller, A. Experiments on the section of the glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog, and observations of the alterations pro- duced thereby in the structure of their primitive fibres. Philos. Trans. R. Soc. Lond. , 423-429 (1849).
