JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Chimica

Isolering og kemisk karakterisering af lipid A fra gramnegative bakterier

Published: September 16, 2013
doi:
10.3791/50623
, , ,
1Section of Molecular Genetics and Microbiology,The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry,The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology,The University of Texas at Austin

Summary

Isolering og karakterisering af lipid A-domænet af lipopolysaccharid (LPS) fra gram-negative bakterier giver indsigt i celleoverflade mekanismer antibiotikaresistens, bakteriel overlevelse og fitness, og hvor kemisk forskellige lipid A molekylspecies differentielt modulere værtens medfødte immunresponser.

Abstract

Lipopolysaccharid (LPS) er den vigtigste celleoverflademolekylet af gram-negative bakterier, anbragt på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlaget. LPS kan opdeles i tre områder: den distale O-polysaccharid, en kerne oligosaccharid og lipid Et domæne bestående af et lipid A molekylære arter og 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic syrerester (KDO). Lipid A domæne er den eneste komponent af afgørende betydning for bakteriecelle overlevelse. Efter sin syntese, er lipid A kemisk modificeret som reaktion på miljømæssige påvirkninger såsom pH eller temperatur, for at fremme resistens over for antibiotika forbindelser, og for at undgå anerkendelse af mediatorer af svar værtens medfødte immunforsvar. Følgende protokol beskriver de små-og store isolation af lipid A fra gram-negative bakterier. Isolerede materiale derefter kemisk karakteriseret ved tyndtlagskromatografi (TLC) eller massespektrometri (MS). Ud over at matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid for flys (MALDI-TOF) MS, vi også beskrive tandem MS-protokoller til at analysere lipid A molekylære arter ved hjælp af elektrospray (ESI) koblet til kollision induceret dissociation (CID) og nyansatte ultraviolet photodissociation (UVPD) metoder. Vores MS protokoller gør det muligt for entydig bestemmelse af kemisk struktur, altafgørende for karakterisering af lipid A molekyler, der indeholder unikke eller nye kemiske modifikationer. Vi beskriver også den radioisotopisk mærkning og efterfølgende isolation af lipid A fra bakterieceller til analyse ved TLC. I forhold til MS-baserede protokoller, TLC giver en mere økonomisk og hurtig karakterisering metode, men kan ikke anvendes til utvetydigt at tildele lipid A kemiske strukturer uden anvendelse af standarder med kendt kemisk struktur. I løbet af de sidste to årtier isolering og karakterisering af lipid A har ført til mange spændende opdagelser, der har forbedret vores forståelse af fysiologi af gram-negative bakterier, mekanismer af antibiotika resistensafstanden, respons menneskets medfødte immunforsvar, og har givet mange nye mål i udviklingen af ​​antibakterielle forbindelser.

Introduction

Lipopolysaccharid (LPS) er den største ydre overflade molekyle næsten alle gramnegative organismer og består af tre molekylære domæner: en distal O-antigen-polysaccharid, en kerne oligosaccharid, og membran-associeret lipid Et domæne aflejret på den ydre blad af ydre membran-dobbeltlag 1,2. Lipid Et domæne består af 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) restkoncentrationer og en lipid A molekylære arter, hvor lipid A kan defineres som den chloroform opløselige del af LPS på mild sur hydrolyse 1, 2. Standarden lipid A molekyle kan kemisk defineret som en diglucosamine rygrad, der er hexa-acyleret og bis-phosphoryleret, i overensstemmelse med de store lipid A-arter observeret i modelorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Ni konstitutivt udtrykte gener, konserverede hele gram-negative bakterier, der er ansvarlige for produktion af lipid A-domæne (figur 1) 1,2. De fleste bakterier har et ekstra sæt af gener, som varierer i graden af fylogenetiske bevarelse, der deltager i yderligere kemisk modifikation af lipid A 3. Dephosphorylering, fjernelse af acylkæder, og tilsætning af kemiske dele, såsom aminosukkere (f.eks aminoarabinose) og / eller phosphoethanolamin er de mest almindeligt observerede aktiviteter (figur 1). Mange af de enzymer, der er ansvarlige for lipid En ændring påvirkes direkte af miljømæssige signaler, såsom divalente kationer, eller deres ekspression reguleres af to komponent respons-regulator systemer 3.

Anerkendelse af lipid A arter af værten medfødte immunsystem er medieret af Toll-lignende receptor 4/myeloid differentiering faktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofobe kræfter mellem MD2 og lipid A acylkæder samt mellem TLR4 og 1 og 4 'phosphatgrupper af lipid A fremmer den stærke associering læbeid A med TLR4/MD2 4,5. Ændringer, der ændrer acylering stat eller den negative ladning af lipid A indvirkning TLR4/MD2 baserede lipid A anerkendelse og nedstrøms stimulering af medfødt immunrespons aktivatorer NF-KB og mediatorer af inflammation, såsom TNFa og IL1-β 6,7. Modifikationer, der maskerer den negative ladning af lipid A også forhindre baktericide kationiske antimikrobielle peptider binde til gramnegativ celleoverflader 3,8. Mange lipid A modifikationer hypotese at øge bakteriel kondition under specifikke miljøforhold, såsom inde i den menneskelige vært eller i en økologisk niche. Af denne grund mange modifikationsenzymer er attraktive mål i en rationel udvikling af antimikrobielle forbindelser. Kemiske diversitet af lipid A-strukturer med hensyn til organisme og / eller miljø, og de biologiske konsekvenser af disse forskellige strukturer gør den strukturelle karakterisering af lipid A en vigtig bestræbelse i than studere af gram-negative bakterier.

Isolering af lipid A molekyler fra hele bakterier involverer ekstraktion af LPS fra den bakterielle celleoverfladen, hydrolytisk trin til at frigøre lipid A, efterfulgt af en endelig rensning procedure 9-11. Det hyppigst citerede LPS udvinding procedure er hot-phenol vand ekstraktion procedure, først introduceret af Westphal og Jann 10.. Efter ekstraktion hele LPS underkastes mild syrehydrolyse, som kemisk adskiller Kdo fra 6'-hydroxylgruppen af den distale glucosamin sukker lipid A (figur 1). Mange faldgruber findes for det varme-phenol vand procedure, herunder anvendelse af en høj risiko reagens, er behovet for at nedbryde medekstraheres nukleinsyrer og proteiner, og flere dage kræves for at fuldføre protokol 10.

Vores lab har videreudviklet udvinding og isolering af lipid A som først udviklet af Caroff og Raetz 12,13. Sammenlignet med hot-phenol vand procedurer, metoden præsenteres her er mere hurtig og effektiv og kan rumme en bred vifte af kultur mængder fra 5 ml til flere liter. I modsætning til hot-phenol vand ekstraktioner, vores metode ikke udvælger til ru-eller glat-typer LPS, giver optimal genvinding af lipid A-arter. I vores protokol, er kemisk lysis af hele bakterieceller udført under anvendelse af en blanding af chloroform, methanol og vand, hvor LPS kan pelleteret ved centrifugering. En kombination af mild syrehydrolyse og opløsningsmiddelekstraktionerne (Bligh-Dyer) anvendes til at frigøre lipid A fra covalent bundet polysaccharid. Fremgangsmåden ifølge Bligh og Dyer blev først anvendt til udvinding af lipid arter fra en række dyre-og plantevæv 14, modificeret her at adskille hydrolyserede polysaccharid fra lipid A. I dette sidste separationstrin, chloroform opløselige lipider selektivt opdele i lavere organisk fase. For yderligere at oprense lipid A, omvendt fase elleranionbyttermateriale søjlechromatografi kan anvendes 12.

Efter isolering af lipid A-arter fra hele celler, kan en række analytiske metoder anvendes til at karakterisere den kemiske struktur af det isolerede materiale, såsom NMR, TLC og MS-analyse. NMR giver mulighed for ikke-destruktiv strukturel udredning og tilvejebringer strukturel detalje relateret til glycosidbindinger, utvetydig tildeling af acylkæde positioner, og tildeling af bindingssteder for lipid A modifikationer som aminoarabinose eller phosphoethanolamin 15-17. NMR-analyse af lipid A er ikke drøftet i vores protokol, men er blevet beskrevet tilstrækkeligt andetsteds 15,16. For hurtig analyse TLC baserede metoder bruges ofte, men undlader at give direkte oplysninger om fine kemiske struktur. MS baserede protokoller er den hyppigst anvendte metode til at karakterisere lipid A-strukturer 18,19. Matrix forbundet laser desorption ionisering (MALDI)-MS er ofte bruges i første omgang kortlægge intakte lipid A-arter. Enkeltvis ladede ioner er genereret ud fra analyt fremstilles ifølge vores ekstraktionsprocedurer. Som der kræves mere fint strukturel analyse, MS / MS baserede metoder bevise mere informativ end MALDI-MS. Koblet til elektrosprayionisering (ESI) enkeltvis eller formere ladet lipid en forløber ioner er yderligere fragmenteret ved kollision induceret dissociation (CID) eller ultraviolet photodissociation (UVPD), til at generere strukturelt informative produkt ioner 18,20,21. Neutrale tab produkter fra lipid A precursor ioner er også ofte genereres under ESI-MS giver en ekstra lag af strukturel information.

Tandem massespektrometri (MS / MS) har vist sig at være et uundværligt og alsidig metode til belysning af lipid A strukturer. I MS / MS, er ioner aktiveres til opnåelse af et diagnostisk fragmentering mønster, som kan anvendes til at belyse strukturen af ​​prækursor-ion. Den mest udbredte available MS / MS metode er CID. Denne metode frembringer fragmentionerne via kollisioner af den valgte prækursor-ion med en inert målgas, hvilket resulterer i energi aflejring, der fører til dissociation. CID har vist sig et kritisk værktøj i tildelingen af lipid A struktur for en lang række bakteriearter 22-33.

Selvom CID er den mest universelt implementeret MS / MS metode, det genererer en begrænset vifte af produkt-ioner. 193 nm UVPD er en alternativ og supplerende MS / MS metode. Denne metode bruger en laser til at bestråle ioner, og absorptionen af ​​fotoner resulterer i aktiveringen af ​​ioner og efterfølgende dissociation. Denne højere energi MS / MS-teknik giver en mere mangfoldig vifte af produkt-ioner end CID og dermed giver mere informative fragmenteringsmønstre. Især UVPD giver information om subtile ændringer i lipid A-arter er baseret på skel på glycosidbindingen, amin, acyl-og CC-obligationer 18,21,34.

Protocol

Alle løsninger skal være forberedt med ultrarent vand og HPLC-kvalitet methanol og chloroform. Fremstillede opløsninger, der indeholder organiske opløsningsmidler, såsom methanol, chloroform eller pyridin og koncentrerede syrer eller baser skal fremstilles og anvendes under et stinkskab. Alle opløsninger kan opbevares ved stuetemperatur. Skal måles Opløsningsmidler i en gradueret glascylinder og opbevaret i glasflasker opløsningsmiddel med PTFE foret hætter. Til langtidsopbevaring chloroform-holdige opløsning…

Representative Results

Canonical lipid A fra E. coli og Salmonella enterica serovar typhimurium er en hexa-acyleret disaccharid af glucosamin med fosfatgrupper på 1 – og 4 '-positioner. Under vækst i rigt medie (fx Luria Broth) en del af lipid A indeholder en pyrophosphat-gruppe i 1-stillingen til opnåelse af en Tris-phosphorylerede arter 36 (fig. 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonsyre), er fastgjort ved 6'-hydroxylgruppen og fungerer som en bro til at forbind…

Discussion

I denne protokol har vi beskrevet isolering af lipid A arter fra hele celler af bakterier, og beskrevet TLC eller MS baserede analysemetoder til kemisk karakterisere denne isolerede materiale. Tandem massespektrometri er en stærk strategi for de novo strukturel karakterisering af biologiske forbindelser, og er uvurderlig for den kemiske karakterisering af opbud af lipid A molekyler observeret i naturen. CID og UVPD er to komplementære aktiverings metoder, der skaber forskellige typer af produkt ioner, der giv…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af tilskud AI064184 og AI76322 fra National Institutes of Health (NIH) og Grant 61789-MA-MUR fra hæren Research Office til MST Research blev også støttet af Welch Foundation Grant F1155 og NIH tilskud R01GM103655 til JSB

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochimica. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Tags

LipopolysaccharideLipid AGram-negative BacteriaCell Surface MoleculeChemical CharacterizationMass SpectrometryThin Layer ChromatographyInnate Immune ResponseAntibiotic Resistance

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Henderson, J. C., O’Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image