Isolering och kemisk karakterisering av lipid A från gramnegativa bakterier
Summary
Isolering och karakterisering av lipid A-domänen av lipopolysackarid (LPS) från gramnegativa bakterier ger en inblick i cellytan baserade mekanismer för antibiotikaresistens, bakteriell överlevnad och fitness, och hur kemiskt varierande lipid A molekylslag modulera differentiellt värd medfödda immunsvar.
Abstract
Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga cellytemolekyl av gramnegativa bakterier som är anbragta på den yttre bipacksedel av yttermembrandubbelskiktet. LPS kan delas in i tre områden: det distala O-polysackarid, en kärna oligosackarid och lipid A-domänen bestående av en lipid A-molekylslag och 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic syrarester (KDO). Den lipid En domän är den enda som är väsentligt för bakteriell cellöverlevnad. Efter dess syntes, är lipid A kemiskt modifierad som svar på miljöstress, såsom pH eller temperatur, till ökad resistens till antibiotiska föreningar, och för att undgå igenkänning av mediatorer av värdens naturliga immunsvar. Följande protokoll specificerar små och storskalig isolering av lipid A från gramnegativa bakterier. Isolerade materialet sedan kemiskt karaktäriseras av tunnskiktskromatografi (TLC) eller masspektrometri (MS). Förutom matris-assisterad laser desorption / jonisering-tid av fljus (MALDI-TOF) MS beskriver vi även tandem MS-protokoll för att analysera lipid A molekylslag med hjälp av elektro (ESI) kopplat till kollision inducerad dissociation (CID) och nyanställd ultraviolett photodissociation (UVPD) metoder. Vår MS-protokoll tillåter entydig bestämning av kemisk struktur, avgörande för karakterisering av lipid A-molekyler som innehåller unika eller nya kemiska modifieringar. Vi beskriver också den radioisotopmärkning, och efterföljande isolering, av lipid A från bakterieceller för analys med TLC. I förhållande till MS-baserade protokoll, ger TLC en mer ekonomisk och snabb karaktärisering metod, men kan inte användas för att entydigt tilldela lipid A kemiska strukturer utan användning av standarder med känd kemisk struktur. Under de senaste två decennierna isolering och karakterisering av lipid A har lett till många spännande upptäckter som har förbättrat vår förståelse av fysiologi av gramnegativa bakterier, mekanismer för antibiotika motstånddelse, den humana medfödda immunsvar, och har gett många nya mål för utvecklingen av antibakteriella föreningar.
Introduction
Lipopolysackarid (LPS) är den huvudsakliga yttre ytan molekyl av nästan alla gramnegativa organismer och består av tre molekylära domäner: en bortre O-antigen polysackarid, en kärna oligosackarid, och membranassocierade lipid A-domänen avsatt på den yttre bipacksedel för yttre membrandubbelskikt 1,2. Den lipid En domän består av 3-deoxi-D-manno-okt-2-ulosonic (KDO) rester och en lipid en molekyl, där lipid A kan definieras som den kloroform lösliga delen av LPS vid mild-sur hydrolys 1, 2. Standarden lipid A-molekylen kan kemiskt definieras som en diglucosamine ryggrad som är hexa-acylerade och bis-fosforylerade; konsekvent med de stora lipid A arterna observerade i modellorganismen Escherichia coli (E. coli) 1,2. Nio konstitutivt uttryckta gener, konserverade hela gramnegativa bakterier, är ansvariga för produktionen av lipid A domän (Figur 1) 1,2. De flesta bakterier som har en ytterligare uppsättning av gener, som varierar i grad av fylogenetisk konservering, att delta i ytterligare kemisk modifiering av lipid A-3. Defosforylering, borttagning av acylkedjor, och tillsats av kemiska delar såsom aminosocker (t.ex. aminoarabinose) och / eller fosfoetanolamin är de vanligast observerade aktiviteter (Figur 1). Många av de enzymer som ansvarar för lipid A modifiering påverkas direkt av miljösignaler, såsom divalenta katjoner, eller deras uttryck regleras av två komponent respons-regulatorsystem 3.
Erkännande av lipid A arter av värd medfödda immunsystemet förmedlas av Toll-like receptor 4/myeloid differentieringsfaktor 2 (TLR4/MD2) co-receptor 4. Hydrofoba krafter mellan MD2 och lipid A acylkedjorna, liksom mellan TLR4 och 1 och 4 'fosfatgrupper av lipid A främja stark sammanslutning av läppid A med TLR4/MD2 4,5. Ändringar som förändrar acyle stat eller den negativa laddningen av lipid A inverkan TLR4/MD2 baserad lipid Ett erkännande och nedströms stimulering av det medfödda immunsvaret aktivatorer NF-kB och mediatorer av inflammation såsom TNF och IL1-β 6,7. Ändringar som döljer den negativa laddningen av lipid A förhindrar också bakteriedödande katjoniska antimikrobiella peptider från att binda till gram-negativa cellytor 3,8. Många lipid A ändringar hypotes att öka bakterie kondition under specifika miljöförhållanden, som t.ex. inuti den mänskliga värden eller i en ekologisk nisch. Av denna anledning många modifierings enzymer är attraktiva mål i en rationell utveckling av antimikrobiella föreningar. Den kemiska mångfalden av lipid A strukturer med avseende på organism och / eller miljö, och de biologiska konsekvenserna av dessa olika strukturer gör strukturbestämning av lipid A en viktig strävan itHan studerar för gramnegativa bakterier.
Isolering av lipid A-molekyler från hela bakterier involverar extraktion av LPS från bakteriecellytan, ett hydrolytiskt steg för att befria lipid A, följt av en slutlig reningsförfarande 9-11. Den oftast citerade LPS extraktionsförfarande är den varm fenol vattenuttag förfarande, först introducerades av Westphal och Jann 10. Efter extraktion hela LPS utsattes för mild syrahydrolys, vilket kemiskt separerar Kdo från 6'-hydroxylgruppen av den distala glukosaminsocker av lipid A (figur 1). Många fallgropar finns för varm fenol vatten förfarande inklusive användning av en hög risk reagens, är behovet av att bryta ned co-extraherade nukleinsyror och proteiner, och flera dagar krävs för att slutföra protokollet 10.
Vårt labb har vidareutvecklat extraktion och isolering av lipid A som först utvecklades av Caroff och Raetz 12,13. Jämfört med varmfenol vatten förfaranden, är den metod som presenteras här mer snabb och effektiv och rymmer ett brett utbud av kulturvolymer från 5 ml till flera liter. Till skillnad från hot-fenol vatten extraktioner, vår metod inte välja för grov-eller släta typer av LPS, som ger optimal återhämtning av lipid A-arter. I vårt protokoll, kemisk lys av hela bakteriella celler utfördes med användning av en blandning av kloroform, metanol och vatten, där LPS kan pelleteras genom centrifugering. En kombination av mild syrahydrolys och lösningsmedelsextraktionerna (Bligh-Dyer) används för att befria lipid A från kovalent bunden polysackarid. Metoden för Bligh och Dyer först tillämpades till utvinning av fettarter från en mängd olika djur-och växtvävnader 14, modifierat här att skilja hydrolyserad polysackarid från lipid A. I denna sista separationssteget, kloroform lösliga lipider selektivt fördelas i den lägre organiska fas. För att ytterligare rena lipid A, omvänd-fas elleranjonbytar-kolonnkromatografi kan användas 12.
Efter isolering av lipid A-arter från hela celler, kan ett antal analytiska metoder användas för att karakterisera den kemiska strukturen hos det isolerade material, såsom NMR, TLC och MS-baserad analys. NMR möjliggör icke-förstörande strukturell belysning, och ger strukturell detalj i samband med glykosidlänkar, entydig tilldelning av acylkedja positioner och tilldelning av fästplatser för lipid A modifieringar som aminoarabinose eller fosfoetanolamin 15-17. NMR-analys av lipid A diskuteras inte i våra protokoll, men har beskrivits på lämpligt sätt på andra ställen 15,16. För snabb analys TLC baserade metoder används ofta, men misslyckas med att ge direkt information om fina kemiska struktur. MS baserade protokoll är de ofta används metoden att karaktärisera lipid A strukturer 18,19. Matrix associeras laserdesorptionsjonisering (MALDI)-MS används ofta för att inledningsvis kart intakta lipid A arterna. Enkelladdade joner genereras från analyt framställd enligt våra extraktionsmetoder. När fler fina strukturell analys krävs, MS / MS-baserade metoder visa sig vara mer informativa än MALDI-MS. Kopplat till elektrosprayjonisering (ESI) för sig eller multiplicera laddad lipid A prekursor joner är dessutom splittrad genom kollision inducerad dissociation (CID) eller ultraviolett photodissociation (UVPD), för att generera strukturellt informativa produktjoner 18,20,21. Neutrala produkter förlust från lipid A-prekursor joner också ofta genereras under ESI-MS ger ett extra lager av strukturell information.
Tandem masspektrometri (MS / MS) har visat sig vara en nödvändig och mångsidig metod för att klarlägga lipid A-strukturer. Under MS / MS, joner aktiveras för att ge ett diagnostiskt fragmenteringsmönster som kan användas för att belysa strukturen av moderjon. Den mest available MS / MS-metoden är CID. Denna metod ger fragmentjoner via kollisioner i den valda moderjon med en inert mål gas, vilket resulterar i energi nedfall som leder till dissociation. CID har visat sig vara ett viktigt verktyg i tilldelningen av lipid En struktur för ett stort antal bakteriearter 22-33,.
Även CID är den mest allmänt implementeras MS / MS-metod, genererar det en begränsad uppsättning av produktjoner. 193 nm UVPD är ett alternativ och komplement MS / MS metoden. Denna metod använder en laser för att bestråla joner, och absorptionen av fotoner resulterar i aktivering av de joner och efterföljande dissociation. Denna högre energi MS / MS-teknik ger ett mer varierat utbud av produktjoner än CID och därmed ger mer informativa fragmenteringsmönster. Framför allt ger UVPD information om subtila förändringar i lipid En art som baseras på klyvningar vid glykosidbindning, amin, acyl och CC obligationer 18,21,34.
Protocol
Representative Results
Discussion
I detta protokoll har vi detaljerade isolering av lipid A arter från hela celler av bakterier, och beskrev TLC eller MS baserade analysmetoder för att kemiskt karakterisera denna isolerade material. Tandem masspektrometri är en kraftfull strategi för de novo strukturell karakterisering av biologiska ämnen, och är ovärderlig för den kemiska karakterisering av arsenalen av lipid A-molekyler som finns i naturen. CID och UVPD är två kompletterande aktiveringsmetoder som skapar olika typer av produktjoner …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag AI064184 och AI76322 från National Institutes of Health (NIH) och av Grant 61789-MA-MUR från Army Research Office till MST forskning stöddes också av Welch Foundation Grant F1155 och NIH bevilja R01GM103655 till JSB
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Thermo Fisher Scientific | C607 | HPLC Grade |
| Methanol | Thermo Fisher Scientific | A452 | HPLC Grade |
| Teflon FEP Centrifuge Bottles | Thermo Fisher Scientific | 05-562-21 | |
| Silica Gel 60 TLC Plates | EMD Biosciences | 5626-6 | |
| Grade No. 3MM Chromatography Paper | Whatman | 3030700 | |
| Orbitrap Elite | Thermo Fisher Scientific | ||
| Mass Spectrometer | |||
| ExciStar XS Excimer Lasrer | Coherent Inc. | ||
| PicoTip Nanospray ESI emitters | New Obectives | ≥ 30 μm to reduce clogging | |
| Model 505 Pulse/Delay Generator | Berkeley Nucleonics Corporation | ||
| Hot Plate Thermoylne 2200 | Barnstead/Thermolyne | HPA2235MQ | |
| 16×125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes | Corning Pyrex | 99449-16X | |
| Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 | Corning | 9999-152 | |
| Personal Molecular Imager System (phosphorimager) | BioRad | 170-9400 | |
| Autoradiography Cassette | Thermo Fisher Scientific | FBCS810 | |
| Phosphorscreen SO230 | Kodak | ||
| Peptide Mass Standards Kit | Sequazyme | P2-3143-00 | |
| Sonifier S250-A | Branson | 101063196 | |
| 1.5 ml 12×32 mm Tapered Base Screw Thread Vial | Thermo Fisher Scientific | C4000-V1 |
Riferimenti
- Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
- Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
- Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
- Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
- Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
- Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
- Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
- Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
- Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
- Westphal, O. a. J., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
- Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
- Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
- Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
- Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
- Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochimica. 45, 14427-14440 (2006).
- Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
- Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
- Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
- Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
- Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
- Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
- Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
- Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
- El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
- Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
- Lee, C. -. S., Kim, Y. -. G., Joo, H. -. S., Kim, B. -. G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
- Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
- Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
- Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -. L., Afonso, C., Tabet, J. -. C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
- Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
- Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
- Jones, J. W., Cohen, i. e., Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
- Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
- Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
- Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
- Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
- Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
- Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
- Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
- Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).
