Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.
Generering og analyse av vaskulære lesjoner i egnede dyremodeller er en hjørnestein i forskning på hjerte- og karsykdommer, genererer viktig informasjon om patogenesen av lesjon formasjonen og virkningen av nye behandlingsformer. Bruk av aterosklerose utsatt mus, kirurgiske metoder for lesjon induksjon, og kosttilskudd modifikasjon har dramatisk forbedret forståelse av mekanismene som bidrar til sykdomsutvikling og potensialet for nye behandlinger.
Klassisk, er analyse av lesjoner utført ex vivo ved hjelp av to-dimensjonale histologiske teknikker. Denne artikkelen beskriver anvendelsen av optisk projeksjon tomografi (OPT) til 3-dimensjonal kvantifisering av arterielle lesjoner. Ettersom denne teknikk er ikke-destruktiv, kan den brukes som et supplement til standard histologiske og immunhistokjemiske analyser.
Neointimale lesjoner ble indusert av wire-innsetting eller ligering av musen femoral arteri mens aterosklerotiske lesjoner ble samlet ved administrering av en aterogen diett til apoE-manglende mus.
Lesjoner ble undersøkt ved hjelp av OPT avbildning av autofluorescent utslipp etterfulgt av komplementær histologisk og immunhistokjemisk analyse. OPT tydelig fremstående lesjoner fra den underliggende vaskulær vegg. Lesjon Størrelsen ble beregnet i to-dimensjonale seksjoner ved hjelp planimetri, muliggjør beregning av lesjon volum og maksimal tverrsnittsareal. Data som er generert ved hjelp av OPT var i samsvar med målinger oppnådd ved anvendelse av histologi, bekrefter riktigheten av teknikken og dens potensial som et komplement (i stedet for alternativ) til tradisjonelle metoder for analyse.
Dette arbeidet viser mulighetene for OPT for bildebehandling aterosklerotiske og neointimal lesjoner. Det gir en hurtig, mye nødvendig ex vivo teknikk for rutinen tre-dimensjonale kvantifisering av vaskulær remodellering.
Dannelsen av arterielle lesjoner er sentralt i høy sykelighet og dødelighet forbundet med kardiovaskulær sykdom 1. Lesjonsdannelse er ansett å være forårsaket av en ubundet inflammatoriske respons på arteriell skade 2. Aterosklerotiske lesjoner dannes langsomt i respons til kronisk skade på arterieveggen, mens restenotic lesjoner utvikle seg raskt etter akutt mekanisk skade (for eksempel etter stent). Mekanismene som bidrar til utvikling av arterielle lesjoner er avklart betraktelig ved bruk av egnede dyremodeller, ofte i kombinasjon med relevante genetiske manipulasjoner en.
Analyse av lesjon størrelse og sammensetning har klassisk avhengig tungt på ex vivo, to-dimensjonal histologi (selv om dette endrer seg med utvikling av forbedrede fremgangsmåter for in vivo og ex vivo deteksjon og analyse av lesjoner i små dyr <sup> 3). Histologisk analyse av arterielle lesjoner er arbeidskrevende, tidkrevende og gir begrenset informasjon av tre-dimensjonal struktur. For eksempel er lesjon belastning vanligvis bestemt ved å måle tverrsnittsarealet av en lesjon (enten ved tilfeldig valgte steder, eller på stedet for maksimal okklusjon). Dette gir en ufullstendig analyse av den samlede belastning lesjon. Hel-montere 3-dimensjonal bildeteknologi gir en mulig løsning på dette problemet, men overraskende få egnede tilnærminger har blitt beskrevet. Dette kan skyldes hovedsakelig til størrelsen på mus arteriene som er for store for enkelt-foton konfokal mikroskopi, men for liten for magnetisk resonansavbildning (MRI) og 4 røntgenberegnet tomografi (CT), 5. Bruk av ex vivo MR og micro CT til studiet av aterosklerotiske lesjoner hos mus antyder de tilbyr begrenset oppløsning, selv i relativt store arterier. Lagt til dette, de relativt lange innhentingstider krevesbegrense gjennomstrømming (og øke skanning kostnader) 4,6.
Utvikling av nye optiske bildediagnostikk (som optisk koherens tomografi 3,7 og foto-akustisk tomografi 8) tilbyr mye potensial for forbedring avbildning av lesjoner i muse arterier. Tilsvarende potensial er vist ved optisk projeksjon tomografi (OPT) som ble utviklet for å tillate analyse av museembryoer. OPT er designet for å bilde eksemplarer spenner fra ~ 0,3 til 10 mm i diameter 9. Transmisjons avbildning registrerer tettheten av et halvgjennomsiktig prøven polykromatisk synlig lys og kan anvendes for identifikasjon av anatomiske strukturer. Utslippsavbildnings poster emisjon av lys etter eksitasjon ved bestemte bølgelengder fra endogene (for eksempel kollagen, elastin) og eksogene fluoroforer i prøven. Dette kan også gi anatomisk informasjon (siden forskjellige vev komponentene kan variere i type og tetthet av autofluorescent artertilstede). Dessuten kan fordelingen av immunoreaktivitet eller genekspresjon bli bestemt ved bruk av egnede fluorescerende prober 10. For enten bildemodus (overføring eller utslipp), blir lyset fokusert til en CCD å tillate iterativ bildeopptak som eksempel roterer (vanligvis 400 bilder på trinn 0,9 °). Disse kan brukes for beregning av volum ved standard tomografiske rekonstruksjonsmetoder (for eksempel filtrert tilbakeprojeksjon (ved hjelp av en kjegle algoritme) eller iterativ rekonstruksjon).
Denne videoen demonstrerer vår nye applikasjon for OPT for rask, kvantifiserbare og kostnadseffektiv 3-dimensjonal analyse av aterosklerotiske og neointimal lesjoner, som tidligere beskrevet i Kirkby et al. 11. Teknikken ble vist seg å være egnet for kvantifisering av lesjon størrelse i tre brukte modeller: (i) femoralarterie wire-skade; (Ii) lårarterie ligering, og (iii) diett-indusert aterosklerose hos apolipoprotein E mangel (apoE – / -) mus.
3-dimensjonal analyse har et stort potensial for å erstatte eller legge til de to-dimensjonale histologiske teknikker som fortsatt ligger til grunn for de fleste undersøkelser av arteriell lesjon formasjonen. Her OPT er vist i små muse arterier (med murine lårarteriene trolig representerer de minste fartøyene som kan analyseres med hell bruke denne teknikken). Det er imidlertid også egnet for bruk med arterier (og lesjoner) fra andre arter, blant annet små til mellomstore menneskelige fartøyer; vår gruppe har med hell brukt teknikken til å analysere lesjoner i kaninaorta (Bezuidenhout et al;. upublisert). OPT løfter hurtigere analyse og øket strukturell informasjon sammenlignet med tradisjonell histologi, og har fordelen av ikke å hindre påfølgende analyse av prøven ved bruk av både histologiske og immunohistokjemiske teknikker.
Bildene produseres ved OPT ga anatomiske detaljer, som viser områder av lesjonsdannelseog størrelsen av lesjoner i disse områdene. Arteriene ble brukt i disse undersøkelser er sannsynligvis nær grensen for oppløsning for teknikken og bildekvalitet er derfor nedsatt til en viss grad av gjenstander (antagelig som følge av rotasjon forskyvning ufullstendig avregning, refleksjon / brytning ved agarose-punktene og fokuseringsproblemer) . Til tross for dette er de detaljer som kreves (dvs. lag av karveggen) forblir merkbar og dermed teknikken er svært nyttig for kvantifisering av enkelte lag. Faktisk kan bildene kvantifiseres hurtig og reproduserbart å tilveiebringe målinger av lesjon og luminal volum i plaque-bærende deler av fartøyet, samt tverrsnittsarealer av lesjonen og lumen på utvalgte steder i prøven. Large (aorta) og mellomstore (femoral, carotis, subclavian) murine arterier – de som vanligvis brukes for analyse av aterosklerotisk og neotintimal lesjon formasjonen i mus – var vellykketanalysert ved hjelp av denne metoden. Faktisk har vi nå brukt OPT å demonstrere effekten av farmakologiske intervensjoner og genetisk manipulasjon på aterosklerotisk og neointimal lesjon størrelse. For eksempel endotelinreseptor blokade endret neointimal lesjonsdannelse mens selektiv sletting av endotelin B-reseptoren fra vaskulærendotelet gjorde ikke 15. I aterosklerose utsatt mus ble genetisk delesjon av enzymene 11β-HSD1 16 eller galectin 3 17 vist å redusere størrelsen av aterosklerotiske lesjoner.
Kvantifisering av lesjon volum er en åpenbar fordel med OPT. Det gir en mer informativ indikasjon av den totale lesjon belastning i en arterie 4 enn det som vanligvis oppnås med histologiske metoder. Analysere hele lesjonen reduserer utvalgsskjevhet og feiling som nødvendigvis vil oppstå når diskrete deler av et fartøy er valgt for analyse. Produksjon av langsgående profiler lesjoner er et ytterligere styrke av OPT, Understreket ved sammenligning av lesjoner indusert av forskjellige typer skader 13,16 (figur 5). For eksempel, både komplett ligation og wire-innsetting indusert nesten total okklusjon nær femero-knehasecyste deli. Wire skade, men gav lesjoner som strakte seg langs hele lengden av det skannede seksjonen, mens lesjoner indusert av arteriell ligering hurtig redusert i størrelse og forsvinne. Dette mønsteret er i overensstemmelse med den større grad av skade forårsaket av tilførsel av det angioplastiske tråden. Generering av lignende resultater ved hjelp av histologiske snitt er kostbart, tidkrevende og arbeidskrevende.
Fordelene med OPT omfatter kvaliteten på bildene det produserer og dens relative hastighet og enkelhet (vi har rutinemessig skannet 20 fartøy per dag). Bildekvalitet vises overlegen eller i det minste sammenlignbare, med andre metoder for å generere tre-dimensjonale bilder ex vivo (for eksempel MRI og mikro- CT), yet OPT krever kortere skanne ganger (integrasjonstiden for våre studier var typisk 1-2sec / bilde) og er rimeligere. Prøveopparbeidelse strekker seg over flere dager, men krever litt arbeid, kan fartøy være forberedt i grupper, og data kan bli kjøpt i én økt. Derfor er gjennomstrømningen høy og krever ikke utvidet bruk av skanneren. Viktigere, betyr det ikke-destruktive natur OPT den kan brukes til å identifisere områder av interesse for immunhistokjemisk undersøkelse; og dermed redusere mengden av skjæring og flekker nødvendig. Det er mulig at utviklingen av høyoppløselig ultralyd vil gi en alternativ metode for volumetrisk kvantifisering av lesjoner i arteriene denne størrelsen, men forfatterne er klar over eventuelle publikasjoner som viser dette programmet.
Kanskje overraskende, er bildekvaliteten i OPT dårligere enn mikroskopiske teknikker (som kan selvfølgelig bare utføres på mindre prøver). Forslag til forbedringer til reconstruction av data kan møte denne begrensningen ved å tillate fremtidige forbedring av bildekvalitet 19,20. En annen metode bekymring er at vev behandling endrer egenskapene til prøven. For eksempel den lipofile natur clearing agent, er sannsynlig å fjerne lipid fra aterosklerotiske lesjoner, mens før dehydrering kan forårsake krymping (men, selvfølgelig, dehydrering og lipid fjerning trinnene er også en funksjon av benzylalkohol / benzylbenzoat (Babb), prøveopparbeidelse for innebygging i parafinvoks). Babb ble brukt i denne undersøkelsen som i sammenligning med hydrofile clearingmidler (f.eks glyserol 21) det fører bare små endringer i morfologi.
Det er flere muligheter for videreutvikling og foredling av OPT, særlig med hensyn til sporing av 3-dimensjonal arrangement av nøkkelceller og signal faktorer involvert i arteriell ombygging. Den sterke autofluorescence arteriell vev, som er en slikN fordel i generering av anatomiske bilder, ikke stoppes ved de eksisterende fremgangsmåter for bleking 22 og kan begrense bruken av fluorescerende prober for å vurdere RNA og proteinfordelingsmønster. Bruken av kolorimetriske prober (f.eks β-galaktosidase) synliggjort ved overføring avbildning kan overvinne denne begrensning.
For å konkludere, OPT har stort potensial for tre-dimensjonal avbildning av lesjoner i intima av murine arterier. Det representerer en betydelig forskudd på to-dimensjonale metoder som er generelt arbeidskrevende og ikke effektivt representerer total lesjon volum. OPT er relativt rask, enkel og ikke-destruktiv. Nye utbygginger i bildeanalyse lover å øke kraften og nytten av teknikk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Stipend fra University of Edinburgh (NSK) og Carnegie Trust (LL; Henry Dryerre ordningen) og midler fra British Heart Foundation (PWFH, BRW, DJW; RG / 05/008; PG / 05/007; PG / 08/068/25 461) og Wellcome Trust (JRS, BRW, DJW; 08314 / Z / 07 / Z). Forfatterne er takknemlige for å støtte for sitt arbeid gitt av BHF-finansierte Senter for fremragende forskning award til Senter for Cardiovascular Science.
Forfatterne er spesielt takknemlig for råd fra professor Masataka Sata (Universitetet i Tokushima) og Dr. Igor Chersehnev (i Dr Ernane Reis 'gruppe ved Mount Sinai School of Medicine) om etablering av de kirurgiske modeller av neointimal lesjon produksjon. Videoen produsert og gjort tilgjengelig av Sata et al. (Http://plaza.umin.ac.jp/~msata/english.htm) var spesielt nyttig.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Operating Microscope | Zeiss, Germany | N/A | OPMI Pico i |
Anaesthetic Machine | Vet Tech, UK | N/A | |
Fluovac | Harvard Apparatus UK | 340387 | |
Fluosorber | Harvard Apparatus UK | 340415 | |
Bead Steriliser | Fine Science Tools, UK | 1800-45 | |
Heated Mat | Fine Sceince Tools, UK | 21061-10 | |
Balance | Mettler Toledo | MS1602S | PB1502 or equivalent |
Sutures | Ethicon, UK | 5/0 Mersilk | |
Guidewire | Cook Inc, USA | C-PMS-251 | 0.014” |
Suture Silk | Fine Science Tools, UK | 18020-60 | 6/0 Mersilk |
Surgical Tools | Fine Science Tools, UK | 14058-09 | Toughcut Iris scissors |
15000-01 | Cohan-Vannas Spring Scissors | ||
11251-35 | Dumont #5/45 Forceps | ||
11370-31 | Moria Iris Forceps | ||
13008-12 | Halsted-Mosquito Haemostat | ||
18050-35 | Bulldog clips | ||
Bioptonics 3001 Tomograph | Bioptonics, UK | N/A | |
Magnetic OPT Mount | Bioptonics, UK | N/A | |
Computer | Dell Inc, UK | N/A | |
Peristaltic pump | Gilson | F117606 | Minipuls 3 |
DataViewer software | Skyscan, Belgium | v.1.4.4 | |
NRecon software | Skyscan, Belgium | v.1.6.8 | |
CTan software | Skyscan, Belgium | v.1.12 | |
Isoflurane | Merial Animal Health Ltd, UK | AP/Drugs/220/96 | 100% Inhalation vapour, liquid |
Medical Oxygen | BOC Medical, UK | UN1072 | |
Vetergesic | Alstoe Animal Health Ltd, UK | N/A | 0.3mg/ml |
1% Lignocaine | Hamlen Pharmaceuticals, UK | LD1010 | 10ml ampoule |
EMLA Cream | Astra Zeneca, UK | N/A | |
Sodium Pentobarbital | Ceva Animal Health Ltd, UK | N/A | |
Western Diet | Research Diets, USA | D12079B | 0.2% cholesterol |
Phosphate Buffered Saline | Sigma UK | P4417 | |
Heparin (Mucous) | Leo Laboratories, UK | PL0043/003GR | 25, 0000 Units |
Neutral Buffered Formalin | Sigma, UK | HT501128 | 10% |
Ethanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20821.33 | Absolute AnalaR |
Agarose | Invitrogen, UK | 16020050 | Low melting point |
Filter Paper | GE Healthcare, UK | 113v | Whatman |
Cyanoacrylate adhesive | Henkel, UK | 4304 | Loctite |
Benzyl alcohol | Sigma, UK | B6630 | |
Benzyl benzoate | Sigma, UK | 402834 | |
Methanol | VWR BDH Prolabo, UK | 20856.296 | 100% |