En datamaskin-assistert Multi-elektrode Patch-clamp System

Summary

Multi-elektrode patch-clamp opptak utgjør en kompleks oppgave. Her viser vi hvordan, ved automatisering av mange av de eksperimentelle skritt, er det mulig å akselerere prosessen fører til kvalitativ forbedring i ytelse og antall innspillinger.

Abstract

Den patch-clamp teknikken er i dag den mest veletablert metode for registrering av elektrisk aktivitet fra enkelte nerveceller eller deres subcellulære avdelinger. Ikke desto mindre å oppnå stabile opptak, og med fra de enkelte celler, er en tidkrevende prosess av betydelig kompleksitet. Automatisering av mange trinn i forbindelse med effektiv informasjonsdisplay kan i stor grad hjelpe experimentalists i å utføre et større antall innspillinger med større pålitelighet og på kortere tid. For å oppnå store innspillinger konkluderte vi den mest effektive tilnærmingen er ikke å fullautomatisere prosessen, men for å forenkle de eksperimentelle skritt og redusere mulighetene for menneskelige feil ved effektivt å innlemme eksperimentator erfaring og visuell tilbakemelding. Med disse målene i tankene vi utviklet et datastøttet system som sentraliserer alle de tiltak som er nødvendige for en multi-elektrode patch-clamp eksperiment i et enkelt grensesnitt, en commercially tilgjengelig trådløs gamepad, mens du viser eksperiment relatert informasjons-og veiledningspekepinner på dataskjermen. Her beskriver vi de forskjellige komponentene i systemet som mulig for oss å redusere den tid som kreves for å oppnå opptakskonfigurasjon og vesentlig øke sjansene for vellykket opptak av et stort antall neuroner samtidig.

Introduction

Kapasitet til å ta opp og stimulere flere nettsteder med mikrometer presisjon er svært nyttig for eksperimentelt å oppnå en bedre forståelse av nervesystemer. Mange teknikker er blitt utviklet for dette formål, men ingen gir den submillivolt oppløsning oppnådd ved patch-clamp teknikk, essensiell for å studere subthreshold aktivitet og enkelte postsynaptiske potensial. Her dekker vi utviklingen av en tolv-elektrode datamaskin-assistert patch-clamp system rettet mot samtidig opptak og stimulere et stort antall enkeltceller med tilstrekkelig presisjon for studiet av nevronale tilkobling. Selv om mange andre anvendelser kan tenkes for et slikt system, gir det seg spesielt godt til studiet av synaptiske tilkoblings gitt at antall mulige forbindelser innen en gruppe av nerveceller vokser proporsjonalt med kvadratet av antall neuroner det gjelder. Derfor, mens et system med tre elektroder gjør det mulig å testeForekomsten av opp til seks forbindelser og oftest innspilling av et eneste, opptak tolv nevroner kan teste forekomsten av opp til 132 forbindelser og ofte observere over ett dusin (figur 1). Observasjonen av en rekke forbindelser som gjør det mulig samtidig å analysere organiseringen av små nettverk og antyde statistiske egenskaper av nettstruktur som ikke kan bli analysert på annen måte ^en. Videre tillater presis stimulering av mange celler også kvantifisering av rekruttering av postsynaptiske celler ^to.

Protocol

En. Utstyr Forberedelse Kontroll manipulatorer fra en datamaskin Koble hver micromanipulator kontrollboks til en datamaskin via serielle porter (RS-232). Implementere kommandoene for posisjonering, spørring og justere innstillinger som skal sendes via den serielle porten. Gitt hastighet og maskinvare kompatibilitetsproblemer C / C + + er anbefalt som programmeringsspråk. Standardreferansesystemet av manipulatorer, slik at null er tettest mulig posisjon i forhold…

Representative Results

Etter de metodene som er beskrevet ovenfor vi lyktes i å utføre hel-celle opptak på opptil tolv nevroner samtidig, nesten en dobling av flest nerveceller samtidig patch-klemmes så langt. Eksempler på nettverk av direkte synaptisk forbindelse mellom Pyramideformet Neurons tatt opp i Layer V i somatosensory cortex hos rotter som er vist i figur 6.. Bestemmelsen av forbindelsen sannsynlighetsprofiler som funksjon av inter-somatisk avstand for en gitt celle-typen er en typi…

Discussion

En umiddelbar spørsmål vanligvis oppstår om frekvensen av suksessen av prosedyren vi beskrevet. For høy suksessrate forberedelser er viktig. Pipetter må ha tips åpninger som er tilstrekkelig for cellenes vesener registrert. Filtrering av den intracellulære løsning for å unngå å tette pipetter er også viktig. Ekstremt rene, nytappet pipetter er et annet krav. En binomial fordeling er den enkleste modell som kan brukes til å forstå hvordan disse forhold påvirker det endelige utbyttet. Det er rimelig å forv…

Materials

Microscope	Olympus	BX51WI	40X Immersion Objective
Manipulators	Luigs & Neumann	SM-5	Serial protocol used
Amplifiers	Axon Instruments	MultiClamp 700B	SDK used
Camera	Till Photonics	VS 55	BNC analog output
Framegrabber	Data Translation	DT3120	SDK used
Oscilloscopes	Tektronix	TDS 2014	Serial communication
Data acquisition	InstruTECH	ITC 1600
Data acquisition	National Instruments	PCI-6221	Library used (.dll)
Pressure valve	SMC	SMC070C-6BG-32
Pressure sensor	Honeywell	24PCDFA6G
Membrane pump	Schego	Optimal