Udskrivning termoresponsive Reverse forme til Oprettelse af Mønstret To komponent Hydrogeler til 3D Cell Culture
Summary
En bioprinter blev brugt til at skabe mønstrede hydrogeler baseret på en opofrende støbeform. Poloxamer Formen blev tilbagefyldt med en anden hydrogel og derefter elueret, hvilket efterlader hulrum, som blev fyldt med en tredje hydrogel. Denne metode bruger hurtig eluering og god trykbarhed af poloxamer at generere komplekse arkitekturer fra biopolymerer.
Abstract
Bioprinting er en ny teknologi, der har sin oprindelse i rapid prototyping industrien. De forskellige grafiske processer kan opdeles i kontakt bioprinting 1-4 (ekstrudering, dip pen og blød litografi), kontaktløs bioprinting 5-7 (laser fremad overførsel, ink-jet deposition) og laser-baserede teknikker såsom to foton fotopolymerisation 8.. Den kan bruges til mange applikationer såsom tissue engineering 9-13, biosensor microfabrication 14-16 og som et redskab til at besvare grundlæggende biologiske spørgsmål såsom påvirkninger af co-dyrkning af forskellige celletyper 17.. I modsætning fælles fotolitografiske eller blød litografiske metoder har ekstrudering bioprinting den fordel, at det ikke kræver en særskilt maske eller stempel. Ved hjælp af CAD-software, kan udformningen af strukturen hurtigt ændres og justeres i henhold til kravene for den enkelte operatør. Dette gør bioprinting mere fleksibelt end litografi-baseredetilgange.
Her viser vi trykning af en opofrende støbeform til at skabe en multi-materiel 3D struktur ved hjælp af en vifte af søjler inden for en hydrogel som et eksempel. Disse søjler kunne repræsentere hule strukturer til en vaskulær netværk eller rørene i en nerve guide ledning. Det valgte materiale til det hellige formen var poloxamer 407, en termoresponsiv polymer med fremragende trykegenskaber som er flydende ved 4 ° C og en fast over sin geleringstemperatur ~ 20 ° C i 24,5% w / v opløsninger 18. Denne egenskab giver poloxamer-baserede blote støbeform til elueres på efterspørgsel og har fordele i forhold til langsom opløsning af et fast materiale, især for smalle geometrier. Poloxamer var trykt på mikroskop objektglas til at skabe det hellige mug. Agarose blev pipetteret ind i formen og afkøles indtil gelering. Efter eluering af poloxameren i iskoldt vand, blev hulrummene i agarose formen fyldt med alginat methacrylat spiked med FITC mærket fibrinogen. De fyldte hulrum blev derefter tværbundet med UV og konstruktion blev afbildet med en epi-fluorescensmikroskop.
Introduction
Tissue engineering tilgange har gjort store fremskridt i de seneste år med hensyn til regenerering af humane væv og organer 19,20. Men indtil nu har fokus for tissue engineering ofte blevet begrænset til væv, som har en simpel struktur eller små dimensioner såsom blæren 21,22 eller huden 23-25. Det menneskelige legeme, indeholder imidlertid mange komplekse tredimensionale væv, hvor celler og ekstracellulære matrix er arrangeret i et rumligt defineret måde. At fremstille disse væv, er en teknik, kræves der kan placere celler og ekstracellulær matrix stilladser i en tredimensional konstruktion ved specificerede positioner. Bioprinting har potentialet til at være sådan en teknik, hvor visionen om fremstilling komplekse tre-dimensionelle væv kan realiseres 10,11,26-28.
Bioprinting defineres som "brug af materiale overførsel processer for mønstret og montage biologisk relvante materialer – molekyler, celler, væv og biologisk nedbrydelige biomaterialer -. med en fastsat organisation til at udrette et eller flere biologiske funktioner "4 Det omfatter flere forskellige teknikker, der arbejder på forskellige opløsninger og længde skalaer, der spænder fra sub-micron opløsning på to -foton polymerisering 29 til en opløsning på 150 um til 420 um for ekstrudering udskrivning 1,12,30. Ikke en eneste, materiale kombination vil opfylde kravene i hver metode 31.. til ekstrudering udskrivning de vigtigste parametre er viskositet og gelering tid 32, hvor høj viskositet og hurtig gelering er ønskelige.
3D-print er en teknik, der gør det muligt nemt at oprette offer forme til at skabe komplekse geometrier 30,33,34. Denne proces er baseret på konstruktionen af en støbeform med en rapid prototyping teknik, såsom en ekstrudering bioprinter. Den oprettede opofrende støbeform anvendesat danne komplekse strukturer af materialer, som er vanskelige at udskrive pga. deres lave viskositet og langsom gelering tid. Fremgangsmåden præsenteres her indebærer etablering af en opofrende støbeform bestående af et materiale, der opløses hurtigt ved lav temperatur og kan ekstruderes præcist. Blokcopolymeren poly (ethylenglycol) 99-poly (propylenglycol) 67-poly (ethylenglycol) 99 (også kendt som Pluronic F127 eller poloxamer 407) opfylder disse krav. Det er allerede blevet anvendt i en modificeret udgave i ekstrudering udskrivning 1, men til vores viden, er aldrig blevet brugt til udskrivning i sin umodificerede udgave på grund af sin ustabilitet i flydende miljøer. Poloxamer 407 viser også en invers termisk reagerende opførsel 18 dvs. det skifter fra en gel til en sol ved afkøling. Vigtigst er det, kan den trykkes i komplekse vilkårligt buede strukturer med meget stor nøjagtighed. Dette giver mulighed for etablering af et struktureret hydrogel fra enlav viskositet materiale, i dette tilfælde langsomme gelering agarose. ved pipettering af opløsningen i den trykte offer skimmel Kombinationen af at udskrive opofrende formen med high fidelity og dens praktiske eluering fra støbt strukturerede hydrogel gør det en hurtig og fleksibel metode til at skabe forme med forskellige geometrier uden brug af en maske eller et stempel som det ofte kræves i litografiske metoder. Den støbt strukturerede hydrogel kan yderligere fyldes med et andet materiale, der ikke er egnet til ekstrudering trykning på grund af sin lave viskositet. Dette er i vores tilfælde en lav viskositet alginat methacrylate løsning. Her præsenterer vi metoden til termoresponsiv reverse offer forme til hydrogel mønstret ved hjælp af eksempel på en søjle array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi for første gang, at anvendelsen af en termoresponsiv polymer til en opofrende støbeform, der hurtigt kan elueres i koldt vand på grund af gel-sol-overgang poloxamer på ~ 20 ° C. Hastigheden af hele processen gør poloxamer interessant for en hurtig oprettelse af biopolymer strukturer, der ikke kan udskrives med tilstrækkelig opløsning. Teknikken beskrevet her kan anvendes til mønsterdannelse en hydrogel i en anden hydrogel eller til oprettelse af mikrofluidkanaler som det tidliger…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Deborah Studer for hjælp med bioprinter.
Arbejdet blev finansieret af Den Europæiske Union syvende rammeprogram (FP7/2007-2013) under tilskudsaftale nr. NMP4-SL-2009 til 229.292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
Riferimenti
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
