Печать Thermoresponsive Пресс-формы для обратной Создание образца двухкомпонентной 3D гидрогелей для клеточных культур
Summary
Биопринтер был использован для создания узорной гидрогелей на основе жертвенной форме. Пресс-форма полоксамер был засыпан со вторым гидрогель и затем элюировали, оставляя пустот, которые были заполнены третий гидрогеля. Этот метод использует быструю элюирования и хорошие печатные полоксамера генерировать сложные архитектуры из биополимеров.
Abstract
Bioprinting является новой технологией, которая имеет свои истоки в отрасли быстрого прототипирования. Различных процессов печати можно разделить на контакт Bioprinting 1-4 (экструзия, падение пера и мягкой литографии), бесконтактные Bioprinting 5-7 (лазер прямого переноса, струйного осаждения) и лазерных технологий, таких как два фотона фотополимеризации 8. Она может быть использована для многих приложений, таких как тканевой инженерии 9-13, биосенсор микротехнологий 14-16 и в качестве инструмента для ответа на основные биологические такие вопросы, как влияние совместного культивирования клеток различных типов 17. В отличие от обычных фотолитографическая или мягкой литографических методов экструзии Bioprinting имеет то преимущество, что она не требует отдельной маски или печать. Использование САПР, конструкция структуры могут быть быстро изменена и скорректирована в зависимости от требований оператора. Это делает Bioprinting более гибкими, чем литографии на основеподходов.
Здесь мы показываем, печати жертвенного формы для создания мульти-материал 3D структуры с использованием массива основных направления, на гидрогеля в качестве примера. Эти колонны может представлять полые структуры сосудистой сети или труб внутри трубопровода руководство нерва. Материал, выбранный для жертвенного форма была полоксамер 407, thermoresponsive полимер с превосходными свойствами печати, который является жидким при 4 ° С и твердый выше его температуры гелеобразования ~ 20 ° C в течение 24,5% вес / объем решений 18. Это свойство позволяет полоксамер основе жертвенный форму, чтобы элюировать по требованию и имеет преимущества по сравнению медленное растворение твердого материала, особенно для узких геометрий. Полоксамер был напечатан на Предметные стекла для создания жертвенной форме. Агарозы пипеткой в пресс-форму и не охлаждается до желатинизации. После элюирования полоксамер в ледяной воде, пустоты в форме агарозном были заполнены альгинат метакрилата зрIKED с FITC меченого фибриногена. Пустоты заполнены затем были сшиты с УФ и конструкцию, полученную с использованием флуоресцентного микроскопа.
Introduction
Тканевая инженерия подходы добились значительного прогресса за последние годы по отношению к регенерации тканей и органов человека 19,20. Тем не менее, до сих пор в центре внимания тканевой инженерии не было часто ограничивается тканями, которые имеют простую структуру или малые размеры таких как мочевой пузырь или 21,22 кожи 23-25. В организме человека, однако, содержит множество сложных трехмерных ткани, где клетки и внеклеточной матрицы размещены в пространственно определенным образом. Для изготовления этих тканей, метод требуется, чтобы можно поместить клетки и внеклеточной матрицы леса в трехмерной конструкции в заданных позициях. Bioprinting имеет потенциал, чтобы быть такой техники, где видение изготовления сложных трехмерных тканей может быть реализована 10,11,26-28.
Bioprinting определяется как "использование процессов о передаче материала для формирования паттерна и монтаж биологически отнЭвант материалов – молекул, клеток, тканей и биоматериалов биоразлагаемых -. с заданной организацией для выполнения одной или нескольких биологических функций "4 Он включает в себя несколько различных методов, которые работают в разных разрешениях и масштабы длины, начиная от субмикронного разрешения двух -фотонные полимеризации 29 с разрешением 150 мкм до 420 мкм для экструзии печати 1,12,30. Ни одного материала или комбинации материалов будет удовлетворять требованиям каждого метода 31. для экструзии печати, ключевыми параметрами являются вязкость и время гелеобразования 32, где высокая вязкость и быстрого гелеобразования желательны.
3D печать это метод, который позволяет легко создавать формы для жертвенных создания сложной геометрии 30,33,34. Этот процесс основан на построении формы помощью быстрого прототипирования техники, таких как экструзия биопринтер. Создано жертвенной форме используетсяобразовывать сложные структуры из материалов, которые являются трудными для печати из-за их низкой вязкостью и медленного времени гелеобразования. Метод, представленный здесь, включает в себя создание жертвенный форму, состоящую из материала, который быстро растворяется при низкой температуре и можно экструдировать точно. Блок-сополимер поли (этиленгликоль) 99-поли (пропиленгликоль) 67-поли (этиленгликоль), 99 (также известный как Pluronic F127 или полоксамер 407) удовлетворяет этим требованиям. Он уже был использован и в измененном виде в экструзии печати 1, но, насколько нам известно, никогда не была использована для печати в его исходной версии из-за его нестабильности в жидких средах. Полоксамер 407 также показывает обратной тепловой реагировать поведение 18 т.е. изменениям из геля в золь при охлаждении. Самое главное, что может быть напечатано в сложные произвольно изогнутые структуры с очень высокой точностью. Это позволяет создание структурированной гидрогель сматериал с низкой вязкостью, в данном случае медленного желирующий агарозы, с помощью пипетки раствор в печатном жертвенный формы. Сочетание печати жертвенного формы с высокой точностью и быстрой элюции с литой структурированный гидрогель делает его быстрый и гибкий способ создания формы с различной геометрии без использования маски или штампа, как это часто требуется в литографических методов. Литой структурированный гидрогель может быть дополнительно заполнены другого материала, который не подходит для экструзии печати из-за его низкой вязкостью. Это в нашем случае низкой вязкости альгината метакрилатом решение. Здесь мы представляем метод обратного thermoresponsive формы для жертвенных гидрогель паттернов на примере столба массива.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы приводим, в первый раз, использование thermoresponsive полимера на жертвенный формы, которые могут быть быстро элюировали в холодной воде за счет гель-золь переход полоксамер ~ 20 ° С. Скорость всего процесса полоксамером делает интересным для быстрого создания биополимеров структур, к…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Дебора Studer за помощь с биопринтер.
Работа финансировалась Европейским Союзом Седьмая рамочная программа (FP7/2007-2013) по гранту соглашения N ° NMP4-SL-2009-229292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
Riferimenti
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
