Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

Summary

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Abstract

Bioprinting es una tecnología emergente que tiene su origen en la industria del prototipado rápido. Los procesos de impresión diferentes se pueden dividir en bioprinting contacto ^1-4 (extrusión, pluma de la inmersión y la litografía blanda), ^5-7 (transferencia de láser hacia adelante, la deposición de chorro de tinta) sin contacto bioprinting y técnicas basadas en láser, tales como dos fotones fotopolimerización ^8. Se puede utilizar para muchas aplicaciones tales como la ingeniería de tejidos ^{9-13, 14-16} y microfabricación biosensor como una herramienta para responder a las preguntas biológicas básicas tales como las influencias de co-cultivo de diferentes tipos de células ^17. A diferencia de métodos fotolitográficos o suave-litográfica comunes, bioprinting extrusión tiene la ventaja de que no requiere una máscara o sello separado. El uso de software CAD, el diseño de la estructura se puede cambiar rápidamente y ajusta de acuerdo con los requisitos del operador. Esto hace que bioprinting más flexible que la litografía basadaenfoques.

Aquí se demuestra la impresión de un molde de sacrificio para crear una estructura de múltiples materiales 3D utilizando una matriz de pilares dentro de un hidrogel como un ejemplo. Estos pilares podrían representar estructuras huecas de una red vascular o los tubos dentro de un conducto de guía del nervio. El material escogido para el molde de sacrificio era poloxámero 407, un polímero termosensible con excelentes propiedades de impresión que es líquida a 4 ° C y un sólido por encima de su temperatura de gelificación ~ 20 ° C durante 24,5 soluciones w / v ^18%. Esta propiedad permite que el molde de sacrificio poloxámero basado en que se eluyó en la demanda y tiene ventajas con respecto a la lenta disolución de un material sólido, especialmente para geometrías estrechas. Poloxámero se imprimió en portaobjetos de vidrio para microscopio para crear el molde de sacrificio. La agarosa se pipeteó en el molde y se enfría hasta la gelificación. Después de la elución de la poloxámero en agua fría de hielo, los huecos en el molde de agarosa se llenaron con alginato de metacrilato spIKED con fibrinógeno marcado con FITC. Los huecos llenos fueron entonces reticuladas con UV y el constructo fue fotografiada con un microscopio de epifluorescencia.

Introduction

Enfoques de ingeniería de tejidos han avanzado mucho en los últimos años con respecto a la regeneración de tejidos y órganos humanos ^19,20. Sin embargo, hasta ahora, el enfoque de la ingeniería de tejidos ha sido a menudo limitado a los tejidos que tienen una estructura simple o de pequeñas dimensiones, tales como la vejiga o la piel ^{21,22 23-25.} El cuerpo humano, sin embargo, contiene muchos tejidos tridimensionales complejas en las que las células y la matriz extracelular están dispuestos de una manera espacialmente definido. Para la fabricación de estos tejidos, se requiere una técnica que puede colocar las células y los andamios de matriz extracelular dentro de una construcción de tres dimensiones en las posiciones especificadas. Bioprinting tiene el potencial de ser una técnica tal donde la visión de la fabricación de tejidos tridimensionales complejas puede ser realizado ^10,11,26-28.

Bioprinting se define como "el uso de los procesos de transferencia de material para modelar y montaje biológicamente relmateriales nentes – moléculas, células, tejidos y biomateriales biodegradables. – con una organización prescrita para llevar a cabo una o más funciones biológicas ^"4 abarca varias técnicas diferentes que funcionan a diferentes resoluciones y escalas de longitud, que van desde la resolución sub-micras de dos polimerización de fotón ²⁹ a una resolución de 150 micras a 420 micras para la impresión de extrusión ^1,12,30. No es un único material o combinación de materiales va a satisfacer los requisitos de cada método ^31. Para la impresión de extrusión, los parámetros clave son la viscosidad y el tiempo de gelificación ^32, donde son deseables alta viscosidad y gelificación rápida.

La impresión 3D es una técnica que permite la fácil creación de moldes de sacrificio para crear geometrías complejas ^30,33,34. Este proceso se basa en la construcción de un molde usando una técnica de prototipado rápido tal como un bioprinter extrusión. Se utiliza el molde de sacrificio creadopara formar estructuras complejas a partir de materiales que son difíciles de imprimir, debido a su baja viscosidad y tiempo de gelificación lenta. El método que aquí se presenta implica la creación de un molde de sacrificio consiste en un material que se disuelve rápidamente a baja temperatura y puede ser extruido con precisión. El bloque de copolímero de poli (etileno glicol) _99-poli (propilenglicol) _67-poli (etilenglicol) ₉₉ (también conocido como Pluronic F127 o poloxámero 407) cumple estos requisitos. Ya se ha utilizado en una versión modificada en la impresión de extrusión ^1, pero, a nuestro conocimiento, nunca se ha utilizado para la impresión en su versión sin modificar debido a su inestabilidad en ambientes líquidos. Poloxámero 407 también muestra un comportamiento de respuesta térmica inversa ¹⁸ es decir, que cambia de un gel a un sol tras el enfriamiento. Lo más importante es que se puede imprimir en las estructuras arbitrariamente curvas complejas con muy alta fidelidad. Esto permite la creación de un hidrogel estructurado a partir de unmaterial de baja viscosidad, en este caso de gelificación lenta de agarosa, con la pipeta la solución en el molde de sacrificio impreso. La combinación de la impresión del molde de sacrificio con alta fidelidad, y su elución rápida del hidrogel estructurado fundido hace que sea un método rápido y flexible para crear moldes con diferentes geometrías sin el uso de una máscara o un sello, ya que se requiere a menudo en métodos litográficos. El hidrogel estructurado fundido puede llenarse aún más con otro material que no es adecuado para la impresión de extrusión debido a su baja viscosidad. Esto es, en nuestro caso una solución metacrilato alginato de baja viscosidad. Aquí presentamos el método de sacrificio termosensible moldes inversa para modelar hidrogel utilizando el ejemplo de una matriz de pilar.

Protocol

1. Preparación de la solución de 407 Poloxámero Si está disponible, lleve a cabo la preparación de la solución de poloxámero en una habitación fría (4 ° C). Si no está disponible, colocar una botella de vidrio en un vaso de precipitados lleno de agua enfriada con hielo. A temperaturas más altas el poloxámero estará por encima del punto de gel y no se disuelve apropiadamente. Añadir 60 ml de solución de PBS frío de hielo en una botella de vidrio y se agita vigorosa…

Representative Results

Los resultados representativos muestran que la técnica inversa del molde (representado en la Figura 2) va a crear un gel estructurada que puede ser llenado con un segundo material. Al comienzo de cada proceso de impresión los parámetros de impresión están optimizados primero. Ajustes paso a paso de los parámetros darán como resultado construcciones multicapa impresos representadas en la Figura 3 y la Figura 4 cuando se imprimen líneas individuales. Si el espesor…

Discussion

Aquí se presenta, por primera vez, el uso de un polímero termosensible para un molde de sacrificio que se pueden eluyó rápidamente en agua fría debido a la transición de gel-sol de poloxámero de ~ 20 ° C. La velocidad de todo el proceso de poloxámero hace interesante para la rápida creación de estructuras de biopolímeros que no se puede imprimir con una resolución adecuada. La técnica descrita aquí puede ser utilizado para modelar un hidrogel dentro de otro hidrogel o para la creación de canales de micro…

Materials

			REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127)	Sigma	P2443
PBS	Invitrogen	10010-015
CAD software	regenHU	BioCAD
Alginate methacrylate	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate	Invitrogen	F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Innovent e.V Technologieentwicklung Jena		Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose	Lonza	50004
			EQUIPMENT
Bioprinter	regenHU	Biofactory
Valve	regenHU	300 μm Nozzel Diameter
Needle	regenHU	150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome	Zeiss
UV Light Source	UVP	Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp	100 W