Abordagens para a frente genéticos em<em> Chlamydia trachomatis</em

Summary

Descreve-se um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química e sequenciação do genoma inteiro. Além disso, um sistema de intercâmbio de ADN no interior das células infectadas está descrito que pode ser usado para o mapeamento genético. Este método pode ser largamente aplicável a sistemas microbianos sem sistemas de transformação e técnicas de genética molecular.

Abstract

Chlamydia trachomatis, o agente etiológico das doenças sexualmente transmissíveis e infecções oculares, permanece mal caracterizado pela sua intratabilidade a transformação experimental com DNA recombinante. Desenvolvemos uma abordagem para realizar a análise genética em C. trachomatis, apesar da falta de técnicas de genética molecular. O método envolve: i) a mutagénese química para gerar rapidamente extensas bibliotecas de mutantes geneticamente definidos, com fenótipos distintos, ii) de toda a sequenciação do genoma (WGS) mapear as lesões genéticas subjacentes e para encontrar as associações entre o gene mutado (s) e.. um fenótipo comum,. iii) geração de estirpes recombinantes por co-infecção de células de mamíferos com bactérias de tipo selvagem e mutante. Assim, fomos capazes de estabelecer relações causais entre os genótipos e fenótipos. O acoplamento de variação do gene quimicamente induzida e WGS para estabelecer associações correlativos genótipo-fenótipo Should ser largamente aplicável à grande lista de interesse médico e ambientalmente microorganismos importantes actualmente insolúveis para a análise genética.

Introduction

Os obrigatórios bactéria intracelular Chlamydia trachomatis contas para um número estimado de 2,8 milhões de infecções do trato genital por ano nos Estados Unidos (Center for Disease Control) com seqüelas associadas, como a doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e infertilidade (1). Chlamydia spp têm uma única fisiologia, com um ciclo de desenvolvimento bifásico consistindo de duas formas: o corpo elementar infecciosa, mas não replicante (EB), e o corpo reticulado mas não infecciosa replicativo (RB). A infecção inicia-se com a ligação de células epiteliais EBS para endoctyotosis seguidos por (2). Dentro de um vacúolo ligada à membrana denominada a inclusão, EBS diferenciar na forma RB, que, em seguida, replica por fissão binária. No meio do ciclo, as transições para trás para o RBS EBS, os quais são, em seguida, expelido para o espaço extracelular para iniciar novos ciclos de infecção, quando as células hospedeiras de lise (3).

C. trachomatis érefractário à manipulação de rotina com técnicas de genética molecular padrão, tais como a substituição do gene alvo, transposons, e transdução de fagos, que têm sido fundamentais para a maioria dos estudos de genética bacteriana, não é claro até que ponto os genes de Chlamydia individuais contribuem para a evasão da imunidade inata , aquisição de nutrientes, transições de desenvolvimento, ou de outros processos importantes para a sobrevivência do patógeno dentro de um hospedeiro eucarióticas (4). Consequentemente, este patógeno permanece mal caracterizado, apesar da sua importância clínica.

Os genomas de Chlamydia spp. são relativamente pequenas (~ 1 Mb) (5) com várias espécies e biovares seqüenciados utilizando tecnologias de seqüenciamento Próxima Geração. Análise do genoma comparativo por WGS tem proporcionado uma visão única sobre a evolução das espécies por clamídia e sua adaptação para os seres humanos (6-8) e em certa medida já forneceu algumas informações sobre a função potencial de fatores de virulência (9, 10). Tele diversidade genética exibida pelos isolados clínicos não fornece a necessária resolução para mapear sistematicamente a função da maioria dos factores de virulência, presumivelmente porque as mutações nesses genes teria sido prontamente seleccionado contra. Sem efeitos de confusão de seleção natural, a variação do gene mutagênico induzido, juntamente com os ensaios definidos que os defeitos medida em virulência, pode expandir o espectro de mutações que podem ser pesquisados. Mutagénicos químicos, em particular, são úteis como eles podem gerar nulo, condicional hypomorphic (função reduzida), e hipermórficos (ganho de função) alelos. Com a chegada das tecnologias de seqüenciamento de genoma robustas de próxima geração, essas mutações podem ser facilmente identificados e mapeados. Deste modo, as associações fortes podem ser feitas entre as mutações no gene ou uma via genética e um fenótipo comum, permitindo a aplicação de abordagens para a frente genéticos.

As seqüências do genoma de estirpes clínicas revelou mosaicismo bsorovares ntre e locos de recombinação freqüente (11). A evidência empírica de recombinação foi demonstrada através da co-infecção de duas linhagens resistentes aos antibióticos diferentes e seleção de dupla progênie recombinante resistente, que foi revelado para ter contribuições genéticas de duas amostras (12, 13). Assim, a transferência genética entre o tipo selvagem e estirpes mutantes em um ambiente de co-infecção permite a segregação de mutações quimicamente induzidas para identificar o gene afectado que conduz ao fenótipo observado.

Aqui, nós descrevemos um método para realizar a análise genética baseada em Chlamydia mutagénese química, WGS, e um sistema para a troca de ADN no interior das células infectadas (14) (Figura 1).

Protocol

1. Chemical Mutagênese Nota: Nós achamos que a forma RB replicativo é mais passível de mutagênese química do que a forma EB. No ciclo médio (entre 18 a 20 hpi), RBs estão em maior números anteriores a RB-EB transição. Porque Chlamydia trachomatis é um agente patogénico intracelular obrigatório, os efeitos do agente mutagénico na saúde do hospedeiro pode limitar a recuperação bacteriana. As células Vero foram encontrados para ser mais resistente aos efeitos adversos …

Representative Results

A exposição a agentes mutagénicos leva a inclusões que aparecem desprovido de bactérias, presumivelmente devido a morte da célula bacteriana. Normalmente, sorotipo LGV-L2 vai lisar completamente as células infectadas dentro de 48 h após a infecção, mas o tratamento com agentes mutagênicos podem estender o ciclo de> 90 h. Cerca de 10% de inclusões devem recuperar. Nas nossas experiências, as células Vero infectadas tratadas com 20 mg / mL de EMS levou a um decréscimo de 99% na recuperação de progenitu…

Discussion

Esta metodologia atende aos requisitos básicos para a análise genética, uma vez que estabelece ligação entre os genótipos e fenótipos. Importante, isto é conseguido sem o auxílio de ferramentas moleculares convencionais de DNA recombinante para a transformação e inactivação por inserção de genes em bactérias, o que é muitas vezes um passo limitante da velocidade para a análise da função dos genes em microrganismos não-modelo.

Um passo importante é a assegurar a clonalid…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-010-CV
Ethyl methanesulfonate (EMS)	Sigma	M0880
Cyclohexamide	Sigma	C4859-1ML
Gentamicin	Life Technologies	15750-060
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies	14190-144
Phosphate buffered saline (PBS) solution with 0.493 mM MgCl2 and 0.901 mM CaCl2 (PBS+MgCl2/CaCl2)	Life Technologies	14040-133
1 M NaOH
5x SPG buffer (1.25 M sucrose, 50 mM sodium phosphate, 25 mM glutamic acid)
SPG buffer (0.25 M sucrose, 10 mM sodium phosphate, 5 mM glutamic acid)
Water (sterile, tissue culture grade)
2x DMEM (prepared from powder, buffered with 7.4 g/L Sodium Bicarbonate	Sigma	D7777
Nonessential amino acids (NEAA)	Life Technologies	11140-050
1.2% GTG Agarose , autoclaved	Lonzo	50070
Genomic DNA purification kits	Qiagen	69504
DNAzol	Life Technologies	10503-027
Ethanol (molecular biology grade)
8 mM NaOH
0.1 M HEPES ( 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) buffer
25 cm2 tissue culture flasks (T25 flasks)
6-well tissue culture plates
12-well tissue culture plates
96-well tissue culture plates
Chemical safety hood
Biological safety hood
>Centrifuge and adaptors for spinning tissue plates
>Dissection microscope
Fluorometer (Qubit)	Invitrogen	Q32866
Adaptive Focused Acoustics S220 instrument	Covaris