Förderung von Überleben und die Differenzierung neuraler Stammzellen mit Fibrin und Growth Factor Cocktails nach schweren Rückenmarksverletzungen
Summary
Fibrin-Matrices, die Wachstumsfaktoren wurden verwendet, um aufgepfropften neuronalen Stammzellen in Websites von kompletten Durchtrennung des Rückenmarks zu behalten. Transplantierten Zellen die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt ist und in mehrere neuronale Zelltypen, einschließlich Neuronen, die Axone in Wirtsrückenmark über lange Distanzen erweitert differenziert.
Abstract
Neuronale Stammzellen (NSCs) können Selbsterneuerung und Differenzierung in Neurone und Gliazellen. Transplantierte NSCs können verlorene Neuronen und Gliazellen nach einer Rückenmarksverletzung (SCI) zu ersetzen, und kann Funktionsrelais zu bilden, um wieder zu verbinden Rückenmarksegmente über und unter einer Läsion. Frühere Studien Transplantation neuraler Stammzellen durch unvollständige Überleben des Transplantats innerhalb des Rückenmarksverletzung Hohlraum begrenzt. Ferner Verfolgung Transplantat Überleben der Zellen, Differenzierung und Verfahren Verlängerung noch nicht optimiert. Schließlich ist in früheren Studien kultivierten Ratten NSC wurden typischerweise berichtet in Glia differenzieren, wenn der verletzten Rückenmarks, anstatt Neuronen gepfropft, außer Schicksal wurde auf einen spezifischen Zelltyp angetrieben. Um diese Probleme anzugehen, haben wir neue Methoden, um das Überleben, Integration und Differenzierung von NSCs zu den Orten der sogar schwere SCI verbessern. NSCs wurden frisch aus embryonalen Tag 14 Rückenmark (E14) von einer stabilen transgenen Rattenlinie Fischer 344 grün fl ausdrücken isoliertuorescent Protein (GFP) und wurden in eine Fibrinmatrix Wachstumsfaktoren enthält, eingebettet ist; diese Formulierung zielte darauf ab, transplantierten Zellen behalten in der Läsion Höhle und unterstützt das Überleben der Zelle. NSCs in der Fibrin / Wachstumsfaktor-Cocktail wurden zwei Wochen nach Brust-Ebene-3 (T3) komplette Rückenmarksquerschnitten erhalten implantiert, wodurch vermieden Spitzenzeiten der Entzündung. Resultierende Transplantate die Läsion Hohlraum vollständig gefüllt und in den beiden Nervenzellen, die Axone in die Wirtsrückenmark über erstaunlich große Entfernungen erweitert und Glia differenziert. Transplantate von kultivierten menschlichen NSCs, die GFP zu ähnlichen Ergebnissen. Somit sind Verfahren zur Verbesserung der neuronalen Stammzelltransplantation, das Überleben und die Analyse der in vivo Befunde definiert.
Introduction
Rückenmarksverletzung (SCI) oft Schäden, die nicht nur der weißen Substanz, die Signale vom und zum Gehirn führen, sondern auch die zentrale graue Substanz, was Segmentverlust von Inter und Motor-Neuronen. Die Folge ist der Verlust der SCI sowohl motorische und sensorische Funktion unterhalb der Läsion. Leider hat der erwachsenen Zentralnervensystem (ZNS) nicht spontan regenerieren, was zu einer dauerhaften Funktionsdefizite ein. Daher ist der Wiederaufbau des verletzten Rückenmarks und Erwachsenen Verbesserung der motorischen, sensorischen und vegetativen Funktion ein wichtiges Ziel der SCI Forschung. Neuronale Stammzellen (NSCs), auch direkt aus embryonalen oder adulten ZNS isoliert, sind überzeugende Kandidatenzellen, um verlorene Neuronen und Glia zu ersetzen. Darüber hinaus sind diese Zellen haben das Potenzial, neue Funktionsrelais bilden axonalen Leitung über eine Läsion 2,3 wiederherzustellen.
Bisher hat es nicht eine detaillierte Erläuterung der anatomischen, electrophysiologische und Verhaltenseffekte von neuronalen Relais Bildung durch transplantierte NSCs nach schweren SCI. Es gibt mehrere Gründe dafür: Erstens, NSCs oder transplantierten fetalen ZNS-Gewebe überleben schlecht, wenn sie in großen Läsion Hohlräume gepfropft. Frühere Studien zeigen erhebliche frühen Zellverlust, so dass große, leere zystische Läsion Hohlräume 4,5. In einigen Studien die transplantierten Zellen anschließend aufteilen würde und füllen die Läsion Hohlraum 4,5, aber dies könnte nach einer Verzögerung von Tagen bis Wochen auftreten, und anschließende Befüllung Läsion möglicherweise nicht vollständig oder konsistent sein. Zweitens, ein effizientes Tracking-System, das Sound-Daten auf das Überleben der Zellen, Differenzierung / Reifung und Auswuchs von transplantierten NSCs bietet fehlte. Die meisten frühen Studien genutzt antegrade und retrograde Markierung zu axonalen Projektionen aus Transplantationen 2,3 verfolgen. Nur teilweise und oft undeutlich markierten axonale Projektionen aus transplantierten Zellen und Tracerverfahren Diese Techniken sind jedoch subjektivt, um Artefakte durch Farbstoff Leckage über den implantierten Zellen. Andere Gruppen verwendet menschlichen spezifischen neuronalen Marker zur axonalen Projektionen nach Transplantation von humanen fötalen NSCs in Rückenmark verletzt Nagetier 5,6 kennzeichnen. Doch in jenen Studien, die Heterotransplantate nicht durchweg gut überleben. Kürzlich, virale Lieferung der GFP-Reporter-Gen wurde verwendet, um kultiviert NSCs 7,8 kennzeichnen. Allerdings war die GFP-Expression oft widersprüchlich und kann nach unten reguliert werden 7. Kürzlich wurde die Verwendung von transgenen Mäusen oder Ratten Spender des Reportergens GFP oder die menschliche plazentale alkalische Phosphatase stabil exprimieren, dramatisch verbessert die Verfolgung von transplantierten neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen in vivo 9,11. Drittens, einige Studien zeigen, dass in vitro kultivierten Ratten NSCs entweder aus embryonalen oder adulten ZNS, ausschließlich in Gliazellen Linien differenzieren, wenn in das Milieu des intakten oder verletzten Erwachsenen Rückenmark transplantiertd 7,12,13, trotz der Tatsache, dass diese neuronalen Stammzellen zur Differenzierung zu Neuronen und Gliazellen sowohl in vitro, was anzeigt, dass die lokalen Umgebungen kann das Schicksal von Stammzellen zu diktieren. Alternativ können kultiviert NSCs, vor allem aus adulten ZNS abgeleitet, intrinsische Eigenschaft defaulty müssen in Gliazellen Linien in vivo 13 unterscheiden.
Aufgrund der oben diskutierten Einschränkungen unserer Gruppe vor kurzem ein neues Protokoll entwickelt, um embryonale NSC-Tracking, das Überleben und die Differenzierung / Reifung in der schwer verletzten Erwachsenen Rückenmark zu verbessern. Kurz gesagt, begannen wir mit einer stabilen transgenen Fischer 344 Ratten-Inzuchtlinie einen GFP-Reporter-Gen, das die GFP-Expression in vivo nach Transplantation erhält 14 abzugeben. Weiter haben wir frisch getrennt NSCs aus embryonalen Tag 14 Fischer 344 Rückenmark, eine Stufe der Entwicklung, die das Potenzial, beide Neuronen und Gliazellen zu generieren behält. Schließlich haben wir eingebettetfrisch gewonnenen NSCs in eine Fibrin-Matrix Wachstumsfaktoren enthält, 15-17, um die Zellen zu halten und verteilen sie in einem großen Hohlraum Läsion, mit dem Ziel, Transplantat Überleben der Zelle, Differenzierung und Integration. Die Transplantate wurden in Websites von T3 komplette Durchtrennung, zwei Wochen nach Verletzungen des Rückenmarks platziert. Diese transplantierten Zellen konsequent gefüllt vollständige Durchtrennung Standorten und in reichlich Neuronen, die eine große Anzahl von Axonen in Wirtsrückenmark über lange Distanzen 18 verlängert differenziert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit kultivierten humanen neuralen Stammzelltransplantate zur Immun-Mangelratten 18 erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine der wichtigsten Hürden für die NSC-Transplantation in das verletzte Rückenmark ist schlecht Überleben in der Läsion entfernt. Alle Lücken oder Hohlräume in der Läsion möglicherweise reduzieren oder zu schwächen, die Bildung von neuronalen Funktionsrelais zwischen supraspinalen Axonen und getrennten Rückenmarksegmente unterhalb der Verletzung. Darüber hinaus kann der schlechten Überlebens gepfropft NSCs ihre Integration mit dem Wirtsgewebe beeinflussen und somit zu reduzieren Konnektivität gepfropft Ne…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Rat Ressourcen-und Research Center, University of Missouri, Columbia, Missouri, für die Bereitstellung von GFP Ratten; Neuralstem Inc. für die Bereitstellung von humanen neuralen Stammzellen. Diese Arbeit wurde von der Veterans Administration, NIH (NS09881), Canadian Spinal Research Organization, The Craig H. Neilsen-Stiftung und der Bernard und Anne Spitzer Charitable Trust unterstützt.
Materials
| Reagents | Company | Catalogue | Comment |
| Fibrinogen(rat) | Sigma | F6755-25MG | 2 hr at 37 °C to dissovle Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Thrombin (rat) | Sigma | T5772-100UN | Dissovle in 10 mM CaCl2 Stock Concentration: 50 U/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| bFGF (human) | Sigma | F0291 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| EGF (murine) | Sigma | E1257 (0.1 mg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| BDNF(human) | Peprotech | 452-02 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| NT-3 (human) | Peprotech | 452-03 (1 mg) | Stock Concentration: 1000 ng/μl Final Concentration: 50 ng/μl |
| GDNF (rat) | Sigma | G1401 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| IGF-1(mouse) | Sigma | I8779 (50 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| aFGF (human) | Sigma | F5542 (25 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| PDGF-AA (human) | Sigma | P3076 (10 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| HGF (human) | Sigma | H9661 (5 μg) | Stock Concentration: 200 ng/μl Final Concentration: 10 ng/μl |
| MDL28170 | Sigma | M6690 (25 mg) | Stock in DMSO Stock Concentration: 1 mM Final Concentration: 50 μM |
| PBS | Millipore | BSS-1005-B | Stock Concentration: 1X Final Concentration: 1X |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| Ketamine | Putney | 26637-411-01 | 40-80 mg/kg Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 25 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd | 0410, | 2.5-8 mg/ml Stock Concentration: 100 mg/ml Final Concentration: 1.3 mg/ml |
| Acepromazine | Butler | 003845 | 0.5-4 mg/ml Stock Concentration: 10 mg/ml Final Concentration: 0.25 mg/ml |
| Betadine | Healthpets | BET16OZ | |
| Ringers | Abbott | 04860-04-10 | 2-3 ml/inj |
| Banamine | Schering-Plough | 0061-0851-03 | 2.5 -5 mg/kg Stock Concentration: 50 mg/ml Final Concentration: 0.5 mg/ml |
| Ampicillin | Sandoz | 0781-3404-85 | 80-100 mg/kg Final Concentration: 50 mg/ml |
| LH-RH | Sigma | L4513 | 200 μg/kg Final Concentration: 200 μg/ml |
| HBSS | Gibco | 14175-096 | |
| Trypsin | Gibco | 25200056 | Stock Concentration: 0.25 % Final Concentration: 0.125 % |
| DMEM | Gibco | 11995073 | |
| FBS | Gibco | 16000044 | Stock Concentration: 100 % Final Concentration: 10 % |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| B27 | Gibco | 17504044 | Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Note, use human reagents for grafts of human NSCs |
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