Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet
Summary
Vi skissere metoder for effektiv og rask isolering / kultur levedyktig microglia fra neonatal cerebral cortex og voksne ryggmargen. Disseksjon og platekledning av kortikale microglia kan oppnås innen 90 minutter, med påfølgende microglial innhøstingen foregår ~ 10 dager etter første disseksjon.
Abstract
Mikroglia er resident makrofag-lignende celler i det sentrale nervesystem (CNS) og, som sådan, har kritisk viktige roller i fysiologiske og patologiske prosesser som CNS modning i utvikling, multippel sklerose, og ryggmargsskade. Microglia kan aktiveres og rekruttert til handling ved neuronal skade eller stimulering, for eksempel aksonal skade sett i MS eller iskemisk hjerneskade som følge av slag. Disse immunkompetente medlemmer av sentralnervesystemet er også antatt å ha roller i synaptisk plastisitet under ikke-patologiske tilstander. Vi benytter protokoller for dyrking microglia fra nyfødte og voksne vev som har som mål å maksimere levedyktig celle tall samtidig minimere konfunderende variabler, for eksempel tilstedeværelse av andre CNS celletyper og cellekultur rusk. Vi bruker store og synbare CNS komponenter (f.eks cortex, ryggmargssegmenter), noe som gjør hele prosessen gjennomførbar og reproduserbar. Bruken av voksen celles er et egnet alternativ til bruk av neonatale hjerne mikroglia, som mange patologier studert hovedsakelig påvirke den postnatale ryggmargen. Disse kultursystemer er også nyttige for direkte testing av effekten av forbindelser som enten hemmer eller fremmer microglial aktivering. Siden microglial aktivering kan forme resultatene av sykdom i voksen CNS, er det behov for in vitro-systemer hvor nyfødte og voksne mikroglia kan dyrkes og studert.
Introduction
Microglia er de fastboende immunceller i CNS, mest tett likner perifere makrofager i struktur og funksjon en. Det har nylig blitt demonstrert at postnatal microglial cellene stammer fra primitive myeloide stamceller, og blir generert før den åttende dagen av embryogenesen upending den forrige forestillingen om at postnatal blodkreft stamceller er kilden til microglia i den voksne hjernen to. De spiller sentrale roller i flere nevrologiske sykdommer og kan raskt svare på infeksjon eller skade ved å slippe pro-inflammatorisk eller anti-inflammatorisk cytokiner tre. Dermed microglia omfatte en frittstående enhet i CNS som kan manipuleres til å påvirke sykdomsutvikling. Utvikle robuste og reproduserbare metoder for å isolere og kultur nyfødte eller voksen microglial celler er viktig for fremtidige studier.
Mikroglia er kjent for å være kritiske aktører i en rekke hjernesykdommer. Flere nylig, roles dukker opp for cellene i normal hjernens utvikling og funksjon som microglia phagocytose overskytende nevrale stamceller fra dentate gyrus av hippocampus 1, 4. Microglia kan også modulere en rekke nevrologiske tilstander som påvirker ryggmargen, for eksempel MS, nevropatisk smerte, og ryggmargsskade 5-7. Ryggmargen mikroglia reagerer forskjellig i forhold til hjernen mikroglia svar på aktiveringssignaler 8, 9, trolig på grunn av forskjeller i nærmiljøet. Derfor er det viktig å etablere en hensiktsmessig in vitro-system til kulturen og studere ryggmarg mikroglia. Neonatal mikroglia produsere betydelig mer av de pro-inflammatoriske cytokin nitrogenoksid sammenlignet med voksne celler etter in vitro stimulering med IFN-γ eller TNF-a-10,11 ytterligere understreker behovet for å benytte voksne celler for å studere mikroglia i sammenheng med visse sykdommer.
Protokollen vi bruker i laboratoriet til cuLTURE neonatal mikroglia er en variant av nyere fremgangsmåter som anvender rister av blandede glial kulturer i et forsøk på å fjerne den mikroglia fra overflaten av cellekultur kolbe 12.. Vi beskriver også en metode for å kultur microglia fra den voksne musen ryggmargen basert på en protokoll først beskrevet av Yip, et al 13. Denne metoden gir en raskere måte å kultur voksne celler sammenlignet med andre tilgjengelige protokoller 14. Det resulterende preparatet er 70% mikroglia, gjenværende andel består av astrocytter. Selv om renhet i vår kultur er lavere i forhold til andre publiserte metoder 13, er denne kulturen system nyttig for å utforske microglial i kultur respons på ulike aktiverende stimuli samt for studiet av sykdommer som i hovedsak påvirker ryggmargen og der en sterk betennelsesreaksjon er en viktig funksjon.
Alle protokoller beskrevet har blitt godkjent av Stony Brook University IACUC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia modulere CNS normal funksjon samt inflammatoriske responser til ulike sykdommer. Funksjonell synaptiske ombygging av mikroglia har vært innblandet i vedlikehold av normal hjerne homeostase 15. Under nevrogen kaskade deltar de i clearance av nevrale stamceller fra dentate gyrus av hippocampus 4, 16. Derfor er det nødvendig å utvikle en kultur-system for å studere nyfødte og voksne mikroglia, som vil dekke alle de skjærer utvikling og voksen alder, gjennom hvilken mikroglia har flere …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke medlemmene av Tsirka lab for deres råd og nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av R01NS42168 til SET, 12PRE12060489 til RB, en NSF-3mt IGERT og en Turner avhandling fellesskap til LT, og NSF-3mt IGERT til JCN.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| EDTA, 5mM | Invitrogen | 15567-028 | |
| Lidocaine, 60mM | Sigma | L-5647 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin/EDTA | Cellgro | 25-052-CI | |
| DMEM, 1X | Cellgro | 10-017 | |
| Sodium Pyruvate | Cellgro | 25-000-Cl | |
| Gentamycin Sulfate | Biowittaker | 17-518Z | |
| 35 x 10mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| Poly-D-Lysine, 100 μg/ml | Dilute 1:20 | ||
| HBSS, 1X | Cellgro | 20-023-CV |
Riferimenti
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial Physiology: Unique Stimuli, Specialized Responses. Ann. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Ginhoux, F., Greter, M., Leboeuf, M., Nandi, S., See, P., Gokhan, S., Mehler, M., Conway, S., Ng, L., Stanley, E., Samokhavalov, I., Merad, M. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330, (2010).
- Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int. J. Env. Res. Pub. Health. 8, 2980-3018 (2011).
- Sierra, A., Encinas, J. M., Deudero, J., Chancey, J., Enikolopov, G., Overstreet-Wadiche, L., Tsirka, S., Maletic-Savatic, M. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Emmetsberger, J., Tsirka, S. Microglial inhibitory factor (MIF/TKP) mitigates secondary damage following spinal cord injury. Neurobiol. Dis. 47, 295-309 (2012).
- Gao, Z., Tsirka, S. E. Animal Models of MS Reveal Multiple Roles of Microglia in Disease Pathogenesis. Neurol Res. Int. , 383087 (2011).
- Beggs, S., Trang, T., Salter, M. W. P2X4R+ microglia drive neuropathic pain. Nature Neurosci. 15, 1068-1073 (2012).
- Olson, J. K. Immune response by microglia in the spinal cord. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1198, 271-278 (2010).
- Batchelor, P. E., Tan, S., Wills, T. E., Porritt, M. J., Howells, D. W. Comparison of inflammation in the brain and spinal cord following mechanical injury. J. Neurotrauma. 25, 1217-1225 (2008).
- Schell, J. B., Crane, C. A., Smith, M. F., Roberts, M. R. Differential ex vivo nitric oxide production by acutely isolated neonatal and adult microglia. J. Neuroimmunol. 189, 75-87 (2007).
- Brannan, C. A., Roberts, M. R. Resident microglia from adult mice are refractory to nitric oxide-inducing stimuli due to impaired NOS2 gene expression. Glia. 48, 120-131 (2004).
- Tamashiro, T. T., Dalgard, C. L., Byrnes, K. R. Primary microglia isolation from mixed glial cell cultures of neonatal rat brain tissue. J. Vis. Exp. (66), e3814 (2012).
- Yip, P. K., Kaan, T. K., Fenesan, D., Malcangio, M. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J. Neurosci. Methods. 183, 223-237 (2009).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. J. Immunol. Meth. 300, 32-46 (2005).
- Ji, K., Akgul, G., Wollmuth, L. P., Tsirka, S. E. Microglia actively regulate the number of functional synapses. PLoS One. 8, e56293 (2013).
- Tremblay, M. -. &. #. 2. 0. 0. ;., Majewska, A. A role for microglia in synaptic plasticity. Comm. Integr. Biol. 4, 220-222 (2011).
- DeWitt, D. A., Perry, G., Cohen, M., Doller, C., Silver, J. Astrocytes regulate microglial phagocytosis of senile plaque cores of Alzheimer’s disease. Expt. Neurol. 149, 329-340 (1998).
- Aloisi, F., Penna, G., Cerase, J., Menéndez Iglesias, B., Adorini, L. IL-12 production by central nervous system microglia is inhibited by astrocytes. J. Immunol. 159, 1604-1612 (1997).
- Min, K. -. J., Yang, M. -. S., Kim, S. -. U., Jou, I., Joe, E. -. H. Astrocytes induce hemeoxygenase-1 expression in microglia: a feasible mechanism for preventing excessive brain inflammation. J. Neurosci. 26, 1880-1887 (2006).
- Sasmono, R., Oceandy, D., Pollard, J., Tong, W., Pavli, P., Wainwright, B., Ostrowski, M., Himes, S., Hume, D. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101, 1155-1163 (2003).
- Ekdahl, C. Microglial activation – tuning and pruning adult neurogenesis. Front Pharmacol. 3, 14 (2012).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A., McEwen, B., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55, 412-424 (2007).
