剥離の再現性があり、持続的な高さが実験的網膜剥離を作成し、網膜下出血せずに、網膜疾患における光受容体細胞損失の病態生理を研究し、潜在的な治療的介入を評価するために重要である。ここでは詳細にこのような方法を報告している。
ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入は網膜剥離(RD)の誘導に広く受け入れられている方法である。ただし、RDまたは網膜下出血の発生の高さと持続時間は、網膜剥離に光受容体細胞死に影響を与えることができる。したがって、光受容体細胞死を評価するために、網膜下出血することなく、再現のRDを作成することが有利である。私たちは、網膜下出血のまれな出来事で再現性のある場所に水疱性と永続はRDSを作成するために、以前に報告された方法を変更しました。この修正された方法の重要なステップは、網膜下腔に注射した後、ヒアルロン酸ナトリウムの漏洩を防止することができますセルフシール強膜切開の作成です。セルフシール強膜切開を行うために、強膜トンネルは30 G針で脈絡膜強膜に浸透した後、作成されます。脈絡膜出血がこの工程の間に発生する可能性がありますが、外科槍で圧迫止血は脈絡膜裾の速度を低下させるorrhage。この方法は、裂孔原性RD、未熟児、糖尿病性網膜症、中心性漿液性脈絡網膜症、加齢性黄斑変性症(AMD)の網膜症などのRDを伴う疾患における光受容体の死のより再現性や信頼性モデルを可能にする。
光受容体は、基礎となる網膜色素上皮から分離されたとき光受容体細胞死とその後の視覚的な減少が起こる。 ( すなわち、網膜の中断によって引き起こされる)、加齢性黄斑変性症(AMD)を含む様々な網膜疾患に見られる光受容体の物理的分離、中心性漿液性脈絡網膜症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症、ならびに裂孔原性網膜剥離( RD)。ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射は光受容体変性1-15の病態生理への洞察を提供し、光受容体細胞死に至るRDを作成するための広く受け入れられているモデルである。
、2001年7で導入ヒアルロン酸ナトリウム網膜下注射により誘導される光受容体の変性は、(数日から数週間)合理的な時間経過の利点を有する。しかし、アニマに動物からの光受容体細胞損失の大幅な変動性を持つことができます1)高さと、RDの期間、網膜下出血の2)の発生:原因RD後の光受容体細胞死に影響を与える二つの大きな要因にL。両方の要因に貢献する方法に急な技術的な学習曲線があります。 RDの高さが光受容体細胞の変性が増加し、網膜色素上皮との間の距離(RPE)層及び光受容体が16-17を増加させるように。これらの報告と一致して、我々の以前の実験は浅いのRDよりも水疱、RDSの詳細光受容体の死を示した。また、網膜下出血、感光体細胞に対して毒性であり、光受容体細胞死18-21に影響を与えることが報告されている。同様に、私たちは、網膜下出血のないのRDよりも網膜下出血、RDS内より光受容体の死を観察した。したがって、変動性を最小限にする技術が網膜下出血を回避しながら、RDの一貫した高さを達成することに焦点を当てる必要があります。
中の我々の変法ducing RDは網膜下出血のまれな出来事で、目の同じ位置に再現性の水疱性と永続RDを行うことができます。我々は、それが他のサイトに比べて、広い術野を達成することが容易であるため、時間的なアプローチを用いて手術を行った。結膜切開の後、自己シール強膜切開は30 G針を用いて行われる。強膜トンネルは、脈絡膜に強膜の浸透が続き、作成されます。脈絡膜出血が、この工程で発生した場合、出血は強膜創を通して眼を終了し、出血は、手術槍で圧迫止血することにより停止することができます。前房の穿刺は、次いで眼内圧を減少させるために角膜から行われる。一人で網膜下注入が生じた網膜動脈閉塞と内側の網膜の虚血で、眼圧の上昇につながるため、これは重要なステップです。ハミルトン10μLシリンジに接続されている33gの針は、その後、網膜下腔に挿入し、3.5μされる;リットルのヒアルロン酸ナトリウムを穏やかに基礎となるRPEからの神経感覚網膜を分離するために注入される。眼底観察下で実行されるRDを誘導する他の方法とは対照的に、この技術は直接観察下で行われる。強膜傷が自己シールなので、ヒアルロン酸ナトリウムは、注入後に漏れ出すことはありません。最後に、接着剤は、創傷強膜上に配置され、結膜は元の位置に再接続される。これらの手順はまた、ヒアルロン酸ナトリウム漏洩のリスクを低減続く。 3.5μlのヒアルロン酸ナトリウムの注入は、8週齢のマウスの目には再現性のRDS(網膜の50%)を作成します。それはこのように、再現性水疱性と永続RDSをも可能にする、目から漏れるの注入されたヒアルロン酸ナトリウムを防ぐため、自己密封傷口を作成すると、私たちの修正された手順の中で最も重要なステップです。
げっ歯類の目には、RDモデルを確立するためのいくつかの方法が3月15日、22を報告されている。それは一般的に、ヒトにおける眼内手術中に使用される粘性物質であり、それは、任意の公知の眼毒性1-15に関連付けられていないため、それらのほとんどは、ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射を利用する。むしろ生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)よりもヒアルロン酸ナトリウムは、RDの持続時間を増加させる。
transvitrealアプローチ3-6または経強膜アプローチ7月15日 :ヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注入のための方法には、2つのアプローチのいずれかを使用します。どちらの方法も、眼底の観察を用いて実施する。 transvitrealアプローチでは、網膜下注入器は、網膜切開が周辺網膜に作成され、硝子体腔に導入され、ヒアルロン酸ナトリウムは、網膜下腔に注入される。この方法では、2つの網膜裂傷、網膜の危険性を増大させる、製造される網膜下腔に入るかもしれませリットル出血。また、網膜切開が作成され、レンズ損傷の危険性がある。経強膜アプローチにはいくつか修正された方法があります。これらの方法7-12のほとんどにおいては、前房の穿刺を有する眼内圧を減少させた後、ヒアルロン酸ナトリウムを充填したシリンジに接続された30 G針が直接結膜、強膜、脈絡膜およびRPEを介して網膜下腔に挿入される。ヒアルロン酸ナトリウムは、その後、網膜下腔に注入される。この経強膜法を用いて網膜裂傷、レンズ損傷の危険性がtransvitrealアプローチを用いるよりも小さい。しかしながら、30 G針によって強膜に形成された孔は、特にマウスの眼のために、大きく、網膜下腔に注入ヒアルロン酸ナトリウムを容易に強膜を介して眼の創傷漏出。これが低いほど、より少ない永続RDおよび複数の可変光受容体細胞死につながる。また、脈絡膜出血が発生した場合眼圧の前網膜下ヒアルロン酸注射に還元されているので、強膜穿孔工程は、出血は、網膜下の空間に広がる。
いくつかの因子が網膜下出血および高さとRD 16-21の永続性の両方を含む、網膜剥離でRDの効果に影響を与えることができる。増加のRD 16、17の高さ、視細胞障害を持つ光受容体細胞死が増加しているため、酸素と浅いRDに比べて高いRDと脈絡から必須栄養素の減少拡散のより広範な場合があります。網膜下出血も、視細胞18〜21のために有毒である。網膜剥離は、この毒性の可能性のあるメカニズムは、低酸素症および網膜下出血による代謝混乱拡散障壁として、および(鉄など)の血液成分によって誘発される直接的な神経毒性が含まれています。をretiに対する保護効果を有することが報告されているレンズの損傷、内部神経節細胞23は 、また、RDの誘導後に感光体細胞死に影響を及ぼし得る。入口創傷部位が密封されていない場合も、ヒアルロン酸ナトリウムは、除核の間に眼の操作に漏れることができる。これは、次に、結果の解釈に影響を与え得る、浅いRDの誤分類につながり得る。
我々のRDの再現性を高め、網膜下出血の速度を減少させるためにヒアルロン酸ナトリウムの網膜下注射用経強方法を変更した。このプロトコルの重要なステップは、注射後ヒアルロン酸ナトリウムの漏れを防止する30 G針を使用して、自己シール強膜切開を作成している。大きな関心が強膜創傷に支払われるように、従来の方法とは異なり、このプロトコルは、眼底の観察なしに実行される。接着剤の適用はまた、眼から漏れるのヒアルロン酸ナトリウムを防止する。我々の経験では、このプロトコルワットで、網膜下出血の割合他のプロトコルと比べて有意に少ない。脈絡膜出血が強膜切開ステップ中に発生した場合は、このステップは、眼圧を低下させる前に行われるので、強膜創を通して眼が終了します。脈絡膜出血が眼圧および感覚神経網膜剥離の還元後に発生した場合、血液が網膜下腔に解剖します。これは他の技術と約10〜20%とは対照的に、症例の約5%で起こることがわかった。これらの動物は、分析から除外されるべきである。
この技術は、光受容体またはRPE細胞24を標的とするベクター媒介遺伝子導入、25の網膜下注射のために使用することができる。これらの注入のための典型的な媒体(PBS、生理食塩水)、ヒアルロン酸ナトリウムよりも大幅に低粘度であるため、標準的な技術は、より多くのリークに悩まされている。本明細書に記載の技術は、このリスクを低減することにより、ベクター導入実験は、より再現性のあることができる信頼できる。
The authors have nothing to disclose.
我々は、重要な見直しの彼女のサポートのためにウェンディチャオに感謝します。この作品は、失明財団(DGV)ライオンズ·アイ·リサーチ·ファンド(DGV)、およびYeattsファミリー(JWMの寛大な寄付を防止するためにボシュロム硝子体網膜フェローシップ(HM)、国立眼研究所の助成EY014104(JWM)、研究によってサポートされていましたとDGV)。
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ketaject | Phoenix | 2010025 | |
AnaSed | LLOYD | 4004821 | |
5% Phenylephrine / 0.5% Tropicamide | Massachusetts Eye and Ear Pharmacy | ||
0.5% Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution | AKORN | 17478-263-12 | |
Provics | Alcon | 8065183085 | |
Webglue | Patterson Veterinary | 07-8566128 | |
Microscope | Leica | MG90 | |
30G1/2 PrecisionGlide Needle | BD | 305106 | |
Weck-Cel Eye Spears | Beaver-Visitec | 0008685 | |
10 Microliter Syringe | Hamilton | 7635-01 | |
33 gauge, 0.5 inch needle | Hamilton | 7803-05 | |
18x18mm Cover Glass | Fisher Scientific | 18-548A |