We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.
Bolvormige tumoren worden steeds meer erkend als een belangrijke in vitro model voor het gedrag van tumorcellen in drie dimensies. Meer fysiologisch relevante dan conventionele hechtende vel culturen, ze nauwkeuriger recapituleren de complexiteit en de effecten zoals die voorkomen in het echte tumoren. Om dit model te benutten om tumorbiologie of de doeltreffendheid van nieuwe therapeutische middelen beter te beoordelen, is het noodzakelijk om te kunnen sferoïden reproduceerbaar te genereren, op een gecontroleerde wijze en in grote aantallen.
Het AggreWell systeem bestaat uit een array met hoge dichtheid van piramidevormige microputjes, waarin een suspensie van afzonderlijke cellen gecentrifugeerd. De aantallen cellen clustering onderaan elk microwell, en het aantal en de verhouding van verschillende celtypen betrokken alleen afhangen eigenschappen van de suspensie die door de experimentator. Zo zijn wij in staat om bolvormige tumoren van willekeurige grootte en samenstelling te genereren metuit om het onderliggende platform technologie wijzigen. De honderden microputjes per vierkante centimeter cultuur oppervlak weer zodat zeer hoge productieniveaus via een eenvoudige, nonlabor-intensief proces kan worden bereikt. Wij verwachten dan ook dat dit protocol in grote lijnen nuttig voor onderzoekers op het bolvormige gebied tumor zal zijn.
Er is een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal dat tumorcellen zich anders gedragen in de driedimensionale culturen dan wanneer ze worden gekweekt op plastic, en dat therapeutische middelen die op conventionele weefselkweek platforms werkzaamheid kunnen verliezen toen overgestapt op een meer fysiologisch-relevante systeem 1. Het is daarom wenselijk om het gedrag van kankercellen bestuderen onder deze omstandigheden, zowel inzicht in de onderliggende biologische verkrijgen en ook de slaagkans van overgang nieuwe therapeutische middelen van de screening mogelijk om de kliniek te verhogen. Een nuttige modelsysteem met een lange historie telt driedimensionale clusters van kankercellen bekend als bolvormige tumoren 1,2. Idealiter zou technieken sferoïde vorming van grote aantallen uniforme bolvormige deeltjes waarvan de omvang en samenstelling worden gecontroleerd door de experimentator mogelijk. Terwijl opknoping-drop en goed-plaat benadert 3,4 zijn in staat om een aantal van deze re vervulleneisen, throughput het algemeen beperkt, en het genereren van grote aantallen sferoïden wordt een arbeidsintensieve taak.
We hebben onlangs een systeem ontwikkeld om soortgelijke uitdagingen in de regeneratieve geneeskunde veld 5 op te lossen. Gebruikmakend gedwongen aggregatie binnen een reeks dicht op elkaar gepakte micronschaal putjes (zie figuur 1), deze benadering maakt de vorming van sferoïden van willekeurige aantallen cellen, inclusief mengsels van verschillende celtypes 6, alsmede de inbouw van verschillende biomaterialen 7. Sferoïden zijn gevormd in grote aantallen – duizenden tot honderdduizenden of meer – en kunnen direct worden geëxtraheerd of gehandhaafd in de microputjes waarin zij zijn gevormd met medium ruil voor tenminste een 8 tot twee (niet gepubliceerde waarneming) weken. Dit systeem is daarom goed geschikt voor het genereren van grote aantallen uniforme en reproduceerbare bolvormige tumoren voor de beoordeling van de effectiveness van nieuwe antitumormiddelen of fundamentele biologische onderzoeken.
Wij hebben een systeem waarbij grote aantallen uniforme sferoïden worden gegenereerd uit meerdere cellijnen van verschillende bronnen opgesteld. We moeten nog een hechtende cellijn die geen bolletjes vormt wel onder deze omstandigheden tegenkomen. We hebben eerder waargenomen cel verlies in populaties gevoelig voor anoikis 5,8, maar tot op heden deze kwestie is niet ontstaan met tumorlijnen. Het systeem is willekeurig schaalbaar oppervlak met gedrag consistent microputjes in 24 putjes en 6 putjes, alsmede prototype bioreactoren met 50.000 microputjes elk in ontwikkeling.
Indien sferoïde asymmetrie een zorg, kan de incubatietijd in stap 4.8 worden verhoogd tot twee of drie dagen. Sferoïden ook gedurende een periode na extractie van de microputjes symmetrie verhogen, maar in dat geval moet worden cultuur dichtheden voldoende laag te houden, als sferoïden in contact met elkaar will vaak samensmelten tot grotere structuren. Daarom hebben we eerder behandelde culturen binnen de microputjes waarin de aggregaten gevormd bij de belangrijkste beperking door de grootte van de sferoïde. Hierdoor is een functie van zowel de groeisnelheid en begingrootte 8 en bij verlenging cultuur binnen de microwell plaat wordt voorzien, moet dit worden beschouwd tevoren. Opties om wildgroei te voorkomen, mocht dat toch gebeuren, onder andere ook te beginnen met kleinere bolletjes, of in dienst van de grotere microwells van de AggreWell 800 plaat.
Indien sferoïden niet toenemen in samenhang verloop van tijd een potentiële oorzaak celdood. Vooral in grotere aggregaten van zeer metabolisch actieve cellen, kan massa beperkingen vervoer over de levering van zuurstof en essentiële voedingsstoffen resulteren in een necrotische kern 2 – dus een niet-samenhangend spheroïde kan slechts een gevolg van overmatig celdood zijn. Als alternatief, metingen van de mechanische samenhangning van sferoïden zijn gebruikt om intercellulaire bindingskrachten beoordelen in verhouding tot het metastatisch potentieel van een bepaalde cellijn 13. Het zou interessant zijn om de relatie tussen de bolvormige vorm en metastatische potentieel te onderzoeken, misschien met behulp van morfometrische parameters zoals rondheid en omtrek-verhouding.
Naast het onderzoeken van de mechanische en morfometrische eigenschappen van sferoïden, opstelling in de microputjes systeem maakt grootschalige productie van gemengde samenstelling sferoïden, bestaande uit combinaties van meerdere celtypes en / of biomaterialen 6,7. De interacties van tumorcellen met andere celtypen belangrijk nauwer modelleren het gedrag van tumoren in vivo 14, dus kan het interessant zijn om sferoïden genereren van tumorcellen in combinatie met fibroblasten en endotheelcellen, bijvoorbeeld. Microdeeltjes van biomateriaal kan ook worden opgenomen, en kan invloed spheroid eigenschappen zowel direct door hun interacties met cellen 7,15, en ook als reservoir voor de gecontroleerde afgifte van groeifactoren en cytokines in het inwendige van de sferoïde 16.
Als er een bezorgdheid over steriliteit, bijvoorbeeld bij het werken met een microwell plaat waarin sommige putten eerder gebruikt, die enige tijd doorgebracht in een incubator als onderdeel van een voorgaande experiment, de putjes worden gesteriliseerd met 70% ethanol in water.
Zodra sferoïden zijn gevormd, kunnen zij ook worden uit de overblijvende niet opgenomen cellen gescheiden door het passeren van de schorsing meer dan een cel zeef. Individuele cellen zal passeren, terwijl de bolletjes blijven behouden. Als de sferoïde wordt vermoed afstoten potentieel metastatische cellen in de loop van de cultuur, kan het wenselijk deze procedure meerdere malen te zijn – aanvankelijk van feitelijke cellen te verwijderen, en vervolgens purifie isolerend populaties van de cellen afgegeven door de bolletjes.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de Universiteit van Calgary, onder een nieuwe onderzoeker start-up subsidie aan Dr Ungrin.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
AggreWell 400 plate | StemCell Technologies Inc. | 27845/27945 | |
Rinsing Solution | StemCell Technologies Inc. | 07010 | |
Cell strainer (37 µm) | StemCell Technologies Inc. | 27215 | |
PBS | VWR / LONZA | CA12001-676 | |
Trypsin-Versene (EDTA) | VWR / LONZA | CA12001-660 | |
DMEM | VWR / LONZA | CA12002-212 | |
FBS | VWR / LONZA | CA-95042-112 | |
TrypLE | Invitrogen / Life Technologies | 12605010 | |
Inverted microscope | VWR / Motic | CA19000-610 | |
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates | VWR / Beckman | CABKA99465, CABK369704, CABK392806 | |
Laminar flow biosafety cabinet | ESBE / Baker | BKR-SG603AHEUVSP |