La risposta immunitaria innata protegge contro l'infezione da organismi patogeni. Una componente fondamentale della risposta immunitaria innata, il burst respiratorio dei fagociti, genera specie reattive dell'ossigeno che uccidono i microrganismi invasori. Descriviamo un saggio burst respiratorio che quantifica specie reattive dell'ossigeno prodotte quando la risposta immunitaria innata è indotta chimicamente.
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Articolo metodologico
Quantificazione della risposta Burst respiratoria come un indicatore di Innate Immune Salute in Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il burst respiratorio dei fagociti è parte della risposta immunitaria innata all'infezione patogeno e comporta la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). ROS sono tossici e la funzione di uccidere i microrganismi fagocitati. In vivo quantificazione dei fagociti di derivazione ROS fornisce informazioni per quanto riguarda la capacità di un organismo di montare una risposta immunitaria innata robusto. Qui si descrive un protocollo per quantificare e confrontare i ROS in interi embrioni di zebrafish dopo induzione chimica del burst respiratorio dei fagociti. Questo metodo fa uso di un composto non fluorescente che diventa fluorescente durante l'ossidazione da ROS. I singoli embrioni di zebrafish sono aggiunti nei pozzetti di una micropiastra e incubate in questo substrato fluorogenico con o senza un induttore chimico del burst respiratorio. Fluorescenza in ogni pozzetto è quantificato in momenti desiderati utilizzando un lettore di micropiastre. Letture di fluorescenza sono rettificati per eliminare fluorescenza di fondo e poi compared utilizzando un t-test per dati non appaiati. Questo metodo permette la comparazione del potenziale burst respiratorio di zebrafish embrioni a diversi stadi di sviluppo e in risposta a manipolazioni sperimentali come proteina smontabile, sovraespressione, o trattamento con agenti farmacologici. Questo metodo può anche essere usato per monitorare la risposta burst respiratorio in interi reni sezionato o preparazioni di cellule di rene di zebrafish adulti e alcune altre specie ittiche. Crediamo che la relativa semplicità e adattabilità di questo protocollo si integrano protocolli esistenti e sarà di interesse per i ricercatori che cercano di comprendere meglio la risposta immunitaria innata.
Introduzione
Il sistema immunitario è costituito da due rami: immunità innata e adattativa. L'immunità innata è evolutivamente più antica di immunità adattativa. Gli invertebrati sono attualmente pensa di avere solo l'immunità innata, mentre i vertebrati possiedono entrambi i rami innata e adattativa. Mentre l'immunità adattativa conferisce l'immunità specifica e di lunga durata a certi agenti patogeni, immunità innata è una risposta immediata ai batteri invasori, virus e funghi. Un aspetto cruciale della risposta immunitaria innata comporta il rilascio di citochine e chemochine, che si traduce in infiammazione e il reclutamento dei fagociti (es. macrofag....
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Protocollo
1. Cura e manutenzione Zebrafish
- Zootecnica: escursione Mass adulto zebrafish come descritto in precedenza 13. Raccogliere gli embrioni generati come descritto in precedenza 14.
- Microiniezione (se desiderato): microinject 1-4 della fase delle cellule di embrioni di zebrafish con oligonucleotidi morpholino al knockdown prodotti genici o mRNA per sovraesprimere prodotti genici come descritto in precedenza 15.
- Mantenere una piscina adeguata di finto controlli iniettato (almeno 48 che vivono, finto iniettato pesci di controllo e 48 di vita, pesci sperimentalmente manipolato sono necessari per riempire un pozz....
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Risultati
Qui, forniamo i dati confrontando la risposta burst respiratorio in embrioni di zebrafish (wild-type, AB sfondo) a 48 e 72 ore dopo la fecondazione (HPF). Le 48 embrioni HPF agito come il nostro gruppo di controllo e 72 HPF embrioni come il nostro gruppo sperimentale. La dimensione del campione utilizzato è stato di 24 embrioni non-indotta e 24 embrioni PMA-indotta per ogni fase di sviluppo. Letture della fluorescenza prime (in unità di fluorescenza relativa (RFU)) sono stati ottenuti leggendo la micropiastra 4 ore dopo.......
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Discussione
La funzione primaria di fagociti è quello di rilevare, inghiottire e distruggere gli agenti patogeni. La capacità dei fagociti di produrre un burst respiratorio adeguato è fondamentale per questa funzione. Pertanto, la quantificazione della risposta burst respiratorio è un metodo per permettere il confronto di salute generale e la funzione immunitaria innata tra gruppi di individui e / o in risposta a manipolazioni sperimentali. Qui, descriviamo un protocollo per indurre, quantificare e confrontare la risposta burst res.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare i membri passati e presenti del laboratorio Kim, Mark Nilan per la cura e la manutenzione zebrafish, il Dr. Robert Wheeler per utili discussioni e la condivisione dei dati, e le sovvenzioni NIH 3RO1GM087308-02S1 e 1P20RR024475-01A2 e il Maine Agricole e Forestali Esperimento Stazione (Numero della pubblicazione 3303) per il finanziamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Instant Ocean Sea | Salt Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grammi | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Piastre di Petri profonde | VWR | 89107-632 | |
| Pipette di trasferimento in plastica | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forcipe Microscopia | elettronica Sciences | 72700-D | |
| 1,7 ml Micro Centrifuga Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| Pipette sierologiche da 5 ml | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Lettore di micropiastre multimodale | BioTek | Contatto BioTek | |
| Black 96 pozzetti Micropiastra | VWR | 82050-728 | |
| Serbatoi sterili da 25 ml | Pipettatore VistaLab | 3054-2003 | |
| Pipettatore | |||
| VWR | 89079-948 | ||
| Puntali per pipette | VWR | 89079-478 |
Riferimenti
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Jr Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the....
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Ristampe e permessi
