En protokol for non-invasiv intraductal levering af vandige reagenser til muse brystkirtel beskrevet. Metoden udnytter lokaliseret injektion i brystvorterne af mælkekirtlerne rettet brystkirtler kanaler specifikt. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.
Heri beskriver vi en protokol til at levere forskellige reagenser til muse brystkirtel via intraductal injektioner. Lokaliseret drug delivery og knock-down af gener indenfor brystepitel har været svært at opnå på grund af manglen på egnede målsøgningsmolekyler der er uafhængige af udviklingsstadier såsom graviditet og amning. Heri beskriver vi en teknik til lokaliseret levering af reagenser til mælkekirtlen på noget tidspunkt i voksenalderen via intraductal injektion i brystvorterne af mus. Injektionerne kan udføres på levende mus under anæstesi, og giver mulighed for en ikke-invasiv og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen. Derudover kan injektioner gentages over flere måneder uden at beskadige brystvorten. Vital farvestoffer såsom Evans Blå er meget nyttigt at lære teknikken. Ved intraductal injektion af det blå farvestof, bliver hele duktalt træet synlige for øjet. Endvidere fluorescerende mærkede reagenser også mulighed forvisualisering og spredning i mælkekirtler. Denne teknik kan tilpasses til en række forskellige forbindelser, herunder siRNA, kemoterapeutiske midler og små molekyler.
Musen brystkirtel er sammensat af en kompleks ductal-alveolære træ, der konvergerer ind i en central kanal på brystvorten. I mus såvel som mennesker, de fleste af brysttumorer oprindelse i de epitelceller, der beklæder mælkekanalerne. Nuværende tilgængelige behandlinger omfatter intravenøs kemoterapi, strålebehandling, og kirurgi. Lokaliseret intraductal behandlinger er blevet udforsket 1-3 og giver betydelige fordele i form af reducerede toksicitet og bivirkninger. Fortsat en række udfordringer Men før disse kan anvendes mere bredt. Evnen til at udføre lignende procedurer i muse brystkirtel letter karakterisering af intraductal interventioner. Her præsenterer vi en ikke-invasiv metode til levering af reagenser direkte i musen brystkirtler kanalen.
Intraductal levering af kemoterapeutiske midler i begge brystkræftpatienter og musemodeller er tidligere blevet vist at være yderst effektiv uden tegn påsystemisk toksicitet eller langvarig histopatologiske forandringer 3-6. Endvidere har tumorcelleinjektion og lentivirusvektor levering af onkogener tidligere blevet vist at være mulig via intraductal injektion 7-10.
Ud over drug delivery, denne fremgangsmåde er nyttig til lokal undertrykkelse af mælkekirtler gener gennem intraductal injektion af siRNA. Injektion af små mængder af siRNA løsning er effektiv uden at ændre anatomi og fysiologi af mælkekirtlen. I vores laboratorium har vi for nyligt vist vellykket undertrykkelse af nøglemediator gener i transgene mus, som spontant udvikler brysttumorer resulterer i forebyggelse af tumorprogression (Brock et al. Upubliceret). Vi har været i stand til at gentage hver anden uge injektioner i samme brystvorter op til 7 gange i 2-ugers intervaller uden synlige vævsskader eller toksicitet.
Intraductal injektioner kan være timet i en voksen mus til at løse udvikopmentally-specifikke begivenheder relevante for mælkekirtlerne udvikling under graviditet, amning, og involution eller at målrette senere stadier i løbet af tumor udvikling og progression. Virgin hunner så unge som 8 uger er blevet injiceret non-invasivt i vores laboratorium.
Transgene og knockout-mus er uvurderlige værktøjer til at studere in vivo rolle enkelte gener i brystkræft. Men det er dyrt og tidskrævende at generere disse dyr og genet knockdown er normalt allestedsnærværende som undertiden udelukker os fra at anerkende de konkrete virkninger af denne gen på mælkekirtler. Derfor vil en målrettet knockdown lindre spørgsmål af ikke-specifikke bivirkninger og toksicitet i andre organer.
Den intraductal injektion af siRNA præsenteres her muliggør lokaliseret genet knockdown i muse brystkirtel. Det er en hurtig fremgangsmåde til en målrettet og lokaliserede drug delivery mælkekirtlen ikke begrænset til siRNA levering. Sådan en brystkirtel-specifik drug delivery undgår uspecifikke bivirkninger og toksicitet til andre organer og giver mulighed for undersøgelse af genændringer på bestemte tidspunkter i løbet af mælkekirtlen udvikling og brysttumor-dannelse. Der er ingen tegn på siRNA-partikler i ikke-injicerede kirtler, leveren eller andre organer med yderligere beviser for, at denne fremgangsmåde viser en foretrukken måde til lokaliseret gen knockdown i mælkekirtlen. Endvidere kan intraductal injektioner gentages ugentligt eller hver anden uge i løbet af flere måneder for at give mulighed for langsigtet overvågning af terapeutiske midler.
Denne teknik åbner mulighed for analyse af intraductal levering af forskellige reagenser muse mamma-kanalerne. Fremskridt i lokaliseret levering i velkarakteriserede musemodeller bør fremskynde anvendelsen af non-invasive, målrettede terapeutiske strategier hos mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Michael Goldberg for at forberede stabiliseret siRNA løsning og Heather Tobin for hendes hjælp med dyrene. Denne undersøgelse blev finansieret af DOD Innovator Award W81XWH-08-1 til 0659 til DEI. Den postdoc uddannelse af SK blev støttet af Susan G Komen Foundation (KG101329). Forfatterne vil gerne takke Kristin Johnson til forberedelse af den skematiske.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |