Inyección intraductal de entrega de la droga localizada a la glándula mamaria de ratón

Summary

Un protocolo para la entrega intraductal no invasiva de los reactivos acuosos para la glándula mamaria de ratón se describe. El método se aprovecha de la inyección localizada en los pezones de las glándulas mamarias dirigidos específicamente conductos mamarios. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos y moléculas pequeñas.

Abstract

Aquí se describe un protocolo para entregar diversos reactivos para la glándula mamaria de ratón a través de inyecciones intraductales. Entrega de la droga localizada y knock-down de los genes en el epitelio mamario ha sido difícil de lograr debido a la falta de moléculas diana apropiadas que son independientes de las etapas de desarrollo, como el embarazo y la lactancia. Aquí se describe una técnica para la administración localizada de los reactivos a la glándula mamaria en cualquier etapa en la edad adulta a través de inyección intraductal en los pezones de los ratones. Las inyecciones se pueden realizar en ratones vivos, bajo anestesia, y permiten una administración de fármacos no invasivo y localizada a la glándula mamaria. Además, las inyecciones se pueden repetir durante varios meses sin dañar el pezón. Colorantes vitales como el azul de Evans son muy útiles para aprender la técnica. Tras la inyección intraductal de colorante azul, todo el árbol ductal se hace visible para el ojo. Por otra parte, los reactivos marcados con fluorescencia también permitenla visualización y la distribución dentro de la glándula mamaria. Esta técnica es adaptable para una variedad de compuestos que incluyen ARNsi, agentes quimioterapéuticos, y pequeñas moléculas.

Introduction

La glándula mamaria de ratón se compone de un árbol-ductal alveolar complejo que converge en un conducto central en el pezón. En los ratones, así como los seres humanos, la mayoría de los tumores de mama se originan en las células epiteliales que recubren los conductos de la leche. Tratamientos actuales incluyen la quimioterapia intravenosa, la radioterapia y la cirugía. Tratamientos intraductal localizadas se han explorado ^1-3 y ofrecer importantes ventajas en términos de reducción de la toxicidad y efectos secundarios. Sin embargo, varios desafíos quedan antes de que estos pueden ser aplicados más ampliamente. La capacidad de realizar procedimientos comparables en la glándula mamaria de ratón facilita la caracterización de las intervenciones intraductales. Aquí presentamos un método no invasivo para la entrega de reactivos directamente en el conducto mamario de ratón.

Entrega intraductal de agentes quimioterapéuticos en ambos pacientes de cáncer de mama y modelos de ratón ha sido previamente demostrado ser muy eficaz sin evidencia detoxicidad sistémica o histopatológico a largo plazo cambia ^3-6. Además, la inyección de células tumorales y de entrega de vector lentiviral de oncogenes han sido previamente demostrado ser factible a través de inyección intraductal ^7-10.

Además de la administración de fármacos, este procedimiento es útil para el silenciamiento de los genes local de la glándula mamaria a través de la inyección intraductal de ARNsi. La inyección de pequeños volúmenes de solución de ARNsi es eficaz sin alterar la anatomía y fisiología de la glándula mamaria. En nuestro laboratorio hemos demostrado recientemente silenciamiento exitosa de genes clave mediador en ratones transgénicos que desarrollan espontáneamente tumores de mama que resulta en la prevención de la progresión del tumor (Brock et al., No publicado). Hemos sido capaces de repetir las inyecciones cada dos semanas en los mismos pezones hasta 7 veces en intervalos de 2 semanas sin ningún daño tisular visible o toxicidad.

Inyecciones intraductal pueden ser programados en un ratón adulto para abordar desarrolloeventos opmentally específicos relacionados con el desarrollo de la glándula mamaria durante el embarazo, la lactancia y la involución o para apuntar últimas etapas durante el desarrollo y progresión del tumor. Las hembras vírgenes de tan sólo 8 semanas de edad se han inyectado de forma no invasiva en nuestro laboratorio.

Protocol

1. Preparación de la solución de inyección Preparar 0,2% colorante azul de Evans en solución salina tamponada de fosfato (PBS) u otra solución acuosa de interés. Este colorante vital es útil para evaluar el éxito de las inyecciones intraductal y se recomienda como una ayuda para la visualización en el desarrollo de conocimientos especializados en la técnica. El volumen requerido dependerá del número y ubicación de las glándulas para ser inyectado. Todos los 10 glándulas mamarias de ratones hembras pueden ser inyectados, pero debido al tamaño más pequeño de la glándula, pares de glándulas 1 y 5 son típicamente inyectados con 10 l de solución. Todos los otros pares mamarias son inyectados con 20 l. Estos volúmenes son suficientes para cubrir todo el árbol ductal. 2. Preparación preoperatoria Anotar el peso corporal de cada ratón. Al igual que con todos los estudios preclínicos, los pesos de los animales deben ser controlados regularmente (dos veces por semana o más) para evaluar la toxicidad potencial. Se anestesia la mOuse usando una cámara de isoflurano y aplicar lubricante ocular. Durante el procedimiento de ratones continuarán siendo anestesiado utilizando inhalado concentración de 2-4% de isoflurano en oxígeno a través de un cono de nariz. Es importante vigilar cuidadosamente el ratón para los cambios en la frecuencia respiratoria, el ajuste del nivel de isoflurano en consecuencia. Inyectar el meloxicam (5-10 mg / kg) por vía subcutánea antes del procedimiento como la analgesia. Aplique una crema de depilación over-the-counter de la zona del pezón. Espere 5 minutos y retire suavemente el cabello suelto con un aplicador de punta de algodón con un movimiento circular. Retire la crema usando toallas de papel húmedas mojadas con agua tibia. El afeitado no se recomienda debido al riesgo de dañar los pezones. Asegure el ratón bajo el estereoscopio pegando suavemente las extremidades. Lugares de inyección limpias con toallitas de alcohol. 3. Inyección intraductal Localice pezones adecuados para ser inyectado bajo el estereoscopio. Utilice fina micro-disección tweezers para eliminar la piel muerta que cubre la abertura del pezón. Cargar 10-20 l de solución de inyección en una jeringa de 50 l con un G cubo de la aguja de metal 33 fijada. A veces, después de la inyección, pequeñas cantidades (1 mu l o menos) pueden filtrarse del pezón al tirar la aguja. Por lo tanto, se recomienda para inyectar 11 o 21 l, respectivamente, para tener en cuenta la pérdida potencial. Sostenga el pezón suavemente con las pinzas finas y levántelo ligeramente para posicionarla para inyección. No es necesario cortar el pezón. Se inyecta la solución lentamente para minimizar el daño potencial causado por el fluido que se mueve rápidamente dentro de los lúmenes ductales. La velocidad de inyección debe mantenerse a aproximadamente 40 l / min. 4. Cuidado Postoperatorio Observe el lugar de la inyección. No debe haber signos de trauma a la región del pezón o el tejido circundante. Hinchazón en el área que rodea el pezón probablemente indica una almohadilla de grasa mamaria Rathe inyecciónR que una inyección intraductal éxito. Quite el animal del cono de la nariz y pasar a una jaula separada para la recuperación. Coloque la jaula bajo una lámpara de calor para prevenir la hipotermia y ayudar en la recuperación. Los ratones son alojados individualmente y serán monitoreados de cerca hasta que recobren el conocimiento y la movilidad. 5. Análisis de glándula mamaria de tejidos Al finalizar el estudio, los ratones se sacrifican por dislocación cervical después de CO 2 de gas comprimido en una cámara de aislamiento. Las glándulas mamarias se extirpan y se pueden usar para la preparación de todo el montaje 11, la histología, o ARN y aislamiento de las proteínas.

Representative Results

Los pezones se pueden localizar fácilmente utilizando un estereomicroscopio una vez que el pelo se ha eliminado en el área que la rodea (Figura 1A). Para dominar la técnica de inyección, se recomienda para inyectar colorante azul de Evans y controlar la integridad de la glándula (Figuras 1B y C). Este enfoque también permite la determinación de volúmenes apropiados para ser inyectada en cada glándula como uno puede evaluar visualmente si el tinte llega a todo el sistema ductal (Figuras 1C y 2A). Una imagen de la imagen azul de Evans inyectado puede entonces compararse a toda montada la glándula mamaria, en la que todo el árbol ductal se tiñe con colorante carmín alumbre (Figura 2B). Tenga en cuenta que la robustez de este método de inyección depende en gran medida el operador. Por ejemplo, perforar el conducto resultará en una almohadilla de grasa mamaria de inyección e inyectar la solución demasiado rápido puede dañar el CEL epitelial ductalLS y provocar una respuesta inflamatoria. Inyección intraductal exitosa permite la entrega localizada de fármacos a la glándula mamaria y reduce los efectos secundarios no específicos observados a menudo lo contrario. Una imagen de ejemplo de una glándula inyectado con marcado con fluorescencia siRNA dirigidos a ciclofilina (un gen no esencial) se muestra en la Figura 3. Figura 1. Una glándula mamaria inguinal inyecta a través del pezón con colorante azul de Evans. A) Aspecto del pezón antes de la inyección y B) después de la inyección con 20 l colorante azul de Evans. No hinchazón o daño tisular se observa. C) Al abrir la piel, el medio de contraste permite la visualización de todo el árbol ductal mamaria. Figura 2. Análisis de azul de Evans en Todo el montajeglándula proyectada. A) Imagen representativa de una glándula diseccionado extirpado del animal y se extendió sobre un portaobjetos de vidrio inmediatamente después de la inyección. B) Total tinción de montaje de la misma glándula con colorante carmín después de grasa había sido despejado. Comparación con A) confirma que la solución inyectada se llena el árbol ductal de mama y de la glándula es anatómicamente intacto. Figura 3. Entrega intraductal de siRNA fluorescente. Imagen representativa de la muestra de tejido fresco, extirpó 48 horas después de la inyección.

Discussion

Los ratones transgénicos y knockout son herramientas muy valiosas para estudiar el papel in vivo de genes individuales en el cáncer de mama. Sin embargo, es costoso y requiere mucho tiempo para generar estos animales y la caída gen es por lo general ubicua que a veces nos impide el reconocimiento de los efectos específicos de ese gen en la glándula mamaria. Por lo tanto, una caída dirigida aliviaría los problemas de efectos secundarios y toxicidades no específicas de otros órganos.

La inyección intraductal de ARNsi que aquí se presenta permite la caída gen localizado en la glándula mamaria de ratón. Es un método rápido para una entrega dirigida de medicamentos y localizada a la glándula mamaria no limitado a la entrega de siRNA. Tal administración de fármacos específico de la glándula mamaria evita efectos secundarios inespecíficos y toxicidad a otros órganos y permite el estudio de las alteraciones de genes en puntos de tiempo específicos durante el desarrollo de la glándula mamaria y la formación de tumores de mama. No hay evidencia de SiPartículas de ARN en las glándulas no inyectados, el hígado u otros órganos que proporcionan evidencia adicional de que este método presenta una forma preferida de caída gen localizado en la glándula mamaria. Además, las inyecciones intraductal pueden repetirse semanalmente o cada dos semanas durante varios meses para permitir la monitorización a largo plazo de los agentes terapéuticos.

Esta técnica abre la posibilidad para el ensayo de la entrega intraductal de diversos reactivos para los conductos mamarios de ratón. Los avances en la entrega localizada en modelos de ratón bien caracterizados deben acelerar la aplicación de la no-invasivo, dirigido estrategias terapéuticas en seres humanos.

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
isoflurane			2-4%
meloxicam			5-10 mg/ml
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129-10G	0.2% in PBS
hair removing cream	Veet		Choose sensitive option
stereoscope	Zeiss	Stemi DV4
micro-dissecting tweezers	Roboz	rs-4976	With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar
Hamilton syringe	Hamilton	7637-01
33-gauge needle	Hamilton	7803-05	point style 4, 12 degree bevel (standard)
siGLO cyclophilin B control siRNA	Dharmacon	D-001610-01-05