En protokoll for den ikke-invasive intraductal levering av vandige reagenser til musemelkekjertlene er beskrevet. Metoden utnytter lokalisert injeksjon i brystvortene av melkekjertlene rettet mot melkegangene spesielt. Denne teknikken kan tilpasses for en rekke forbindelser inkludert siRNA, kjemoterapeutiske midler og små molekyler.
Heri beskriver vi en protokoll for å levere ulike reagenser til musemelkekjertlene via intraductal injeksjoner. Lokalisert medikamentavgivelse, og knock-down av gener innenfor melkekjertelepitelet har vært vanskelig å oppnå på grunn av mangel på egnede målsøkende molekyler som er uavhengige av utviklingsstadier slik som graviditet og laktasjon. Heri, beskriver vi en teknikk for lokaliserte levering av reagenser til melkekjertlene på ethvert stadium i voksen alder via intraductal injeksjon i brystvortene av mus. Injeksjoner kan utføres på levende mus, under narkose, og gi rom for en non-invasiv og lokalisert levering av legemidler til melkekjertlene. Videre kan injeksjonene gjentas over flere måneder uten å skade brystvorten. Vital fargestoffer som for eksempel Evans Blå er svært nyttig for å lære teknikken. Ved intraductal injeksjon av det blå fargestoff, blir hele ductal treet synlig for øyet. Videre fluorescensmerkede reagenser også tillatevisualisering og distribusjon innenfor melkekjertlene. Denne teknikken kan tilpasses for en rekke forbindelser inkludert siRNA, kjemoterapeutiske midler, og små molekyler.
The mouse mammary gland er sammensatt av en kompleks ductal-alveolar tre som konvergerer inn i en sentral kanal i nippelen. Hos mus så vel som mennesker, de fleste av brystsvulster oppstår i epitelceller lining melkekanalene. Dagens tilgjengelige behandlinger inkluderer intravenøs kjemoterapi, stråling og kirurgi. Lokaliserte intraductal behandlinger har blitt utforsket 1-3 og gi betydelige fordeler i form av reduserte toksisitet og bivirkninger. Men flere utfordringer gjenstår før disse kan brukes mer allment. Evnen til å utføre tilsvarende prosedyrer i musen melkekjertlene forenkler karakterisering av intraductal intervensjoner. Her presenterer vi en ikke-invasiv metode for levering av reagenser direkte inn i musemelkekanalen.
Intraductal levering av kjemoterapeutika i begge brystkreftpasienter og musemodeller har tidligere vist seg å være svært effektiv med ingen bevis forsystemisk toksisitet eller langsiktig histopatologiske forandringer 3-6. Videre har tumorcelle-injeksjon og lentiviral vektor levering av onkogener tidligere påvist å være mulig via intraductal injeksjon 7-10.
I tillegg til levering av legemidler, er denne prosedyren nyttig for lokal stanse av brystkjerteltumorer gener gjennom intraductal injeksjon av siRNA. Injeksjon av små mengder siRNA løsningen er effektiv uten å endre anatomi og fysiologi av melkekjertlene. I vårt laboratorium har vi nylig vist seg vellykket stanse av nøkkel-mediator gener i transgene mus som spontant utvikler brysttumorer som resulterer i forhindring av tumorprogresjon (Brock et al. Upublisert). Vi har vært i stand til å gjenta annenhver uke injeksjoner i de samme brystvortene opp til syv ganger i 2-ukers intervaller uten synlige vevsskade eller toksisitet.
Intraductal injeksjoner kan være tidsbestemt i en voksen mus å ta utvikopmentally-spesifikke hendelser som er relevante for melkekjertlene utvikling under graviditet, amming, og involusjon eller å målrette senere stadier under tumor utvikling og progresjon. Virgin kvinner så unge som åtte ukers alder har blitt injisert non-invasiv i vårt laboratorium.
Transgene og knockout mus er uvurderlige verktøy for å studere in vivo rollen individuelle gener i brystkreft. Det er imidlertid kostbart og tidkrevende å generere disse dyrene og genet knockdown er vanligvis allestedsnærværende, som av og til umulig å foreta oss å gjenkjenne den spesifikke virkninger av genet i melkekjertlene. Derfor ville en målrettet knockdown avhjelpe problemene med ikke-spesifikke bivirkninger og toksisitet i andre organer.
Den intraductal injeksjon av siRNA presenteres her gjør det lokaliserte genet knockdown i musen melkekjertlene. Dette er en hurtig metode for en målrettet og lokalisert levering av legemidler til melkekjertlene ikke begrenset til siRNA levering. En slik melkekjertlene-spesifikk levering av legemidler unngår uspesifikke bivirkninger og toksisitet til andre organer, og gjør det mulig for studiet av genet endringer ved bestemte tidspunkter i løpet av melkekjertlene utvikling og brysttumordannelse. Det er ingen tegn på siRNA partikler i ikke-injisert kjertler, lever eller andre organer som gir ytterligere bevis på at denne metoden presenterer en foretrukket metode for lokaliserte genet knockdown i melkekjertlene. Videre kan intraductal injeksjoner gjentas hver uke eller annenhver uke i løpet av flere måneder for å tillate langtidsovervåkning av terapeutiske midler.
Denne teknikken åpner opp muligheten for å analysere den intraductal leveranse av forskjellige reagenser til musemelkekanalene. Fremskritt i lokaliserte levering i godt karakterisert musemodeller bør akselerere bruken av ikke-invasiv, målrettede terapeutiske strategier hos mennesker.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Michael Goldberg for å forberede stabilisert siRNA løsning og Heather Tobin for hennes hjelp med dyrene. Denne studien ble finansiert av DOD Innovator Award W81XWH-08-1-0659 til DEI. Postdoktor opplæring av SK ble støttet av Susan G Komen Foundation (KG101329). Forfatterne ønsker å takke Kristin Johnson for utarbeidelse av skjematisk.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
isoflurane | 2-4% | ||
meloxicam | 5-10 mg/ml | ||
Evans blue dye | Sigma-Aldrich | E2129-10G | 0.2% in PBS |
hair removing cream | Veet | Choose sensitive option | |
stereoscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
micro-dissecting tweezers | Roboz | rs-4976 | With a 0.10 x 0.06 mm tip made of dumostar |
Hamilton syringe | Hamilton | 7637-01 | |
33-gauge needle | Hamilton | 7803-05 | point style 4, 12 degree bevel (standard) |
siGLO cyclophilin B control siRNA | Dharmacon | D-001610-01-05 |