稳态，稳定前的状态，单营业额动力学测量DNA糖基化酶活性
Summary
时间8 – 羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶糖基化酶活性课程双相参展产品的形成和爆发出的线性稳态阶段。利用淬火流技术中，突发和可以测量的稳态速率，分别对应到8 – 羟基鸟嘌呤和释放从产物DNA糖基化酶切除。
Abstract
人类8 – 羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1），切除从DNA诱变氧化性DNA损伤-8 – 氧代-7,8 – dihydroguanine（8-oxoG）。 OGG1动力学特性进行测量8 oxoG切除率和产品发布。当的OGG1浓度的低于底物DNA，产物的形成的时间过程是双相的，随后由一个线性稳态阶段产品形成的快速指数阶段（ 即脉冲串）。产物的形成的初始脉冲串对应的正确啮合在基片上的酶的浓度，和脉冲串的幅度取决于酶的浓度。一阶速率常数的突发对应的内在8 oxoG切除率和速度较慢的稳态测量产品的发行率（产品DNA解离速率常数，k 关闭 ）。在这里，我们描述了稳定状态，稳定状态，单营业额的方法来隔离和测量SPecific步骤在OGG1催化的循环。含病变的荧光标记的寡核苷酸和纯化OGG1是用来方便精确的动力学测量。由于酶浓度低，用来做稳态测量，人工搅拌反应试剂和淬火，可以进行确定的稳态率（K 关闭 ）。此外，外推在零时间，纵轴上的点的稳态速率表明的产物的形成过程中发生一个脉冲串的第一个营业额（ 即 y轴截距为正）。可以测量使用的是快速混合和猝灭技术，检查形成在短的时间间隔（<1秒）之前的稳态阶段的产品的量和对应的速率为8的一级速率常数的指数的脉冲串相位oxoG切除术（化学）。化学步骤也可以使用一个单一的营业额的方法测量催化循环防止饱和底物DNA酶（E> S）。这些方法可以测量的基本速率常数的影响的效率去除的DNA损伤。
Introduction
一个有氧环境加快基因组不稳定。甲的主要promutagenic DNA病变导致的氧化应激是7,8 – 二氢-8 – 羟基鸟嘌呤（8-oxoG）。这是由于8-oxoG的暧昧编码潜力。 8 oxoG发起碱基切除修复负责人8 – 羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）。 OGG1切除8 oxoG基地，导致一个的嘌呤网站（AP站点）产品DNA糖基化酶活性。在某些情况下，一个弱OGG1裂解酶活性可以切割的AP站点。
一般动力学特性的DNA糖基化酶发现，他们表现出双相时间课程。在经过最初的快相产物的形成（ 即脉冲串），观察到的线性稳态阶段1-3。这种行为是表示化学（ 即构象变化或产品释放）过程中的时间过程的线性部分的限速的步骤，而钻针圣相，通常被称为“过渡阶段，在第一个周期的反应产物的形成，可在酶的活性位点相对应。当产品发布速率限制在稳态阶段，活动的测量提供了定性测量产品DNA结合的亲和力，但没有提供有关的酶的活性部位（ 即化学）事件的动力学信息。因此，需要的方法来分离和测量指数的预稳态脉冲串相位探测事件的过程中的第一酶在酶的活性位点4的营业额。
有三种标准的动力学方法OGG1催化行为的特征，（1）稳定状态，（2）预稳定的状态，和（3）单成交。这些方法彼此不同的酶的浓度在反应混合物中的每一种方法中使用的酶底物比。在一个典型的稳态的方法，有时也被称为多周转动力学，使用低浓度的酶按照产物的形成。当底物浓度大大超过酶的浓度，以便多个酶失误不显着影响底物浓度。在这种情况下，时间场应该是线性的，它往往是难以辨别是否发生突发过程中的第一个营业额，由于在这种方法中使用的酶浓度低;注意，脉冲串的幅度是酶的浓度相当于。这是可以克服的，通过使用较高的酶浓度和外推线性时间当然零时间检测是否很快就发生了第一种酶营业额。纵坐标（y轴）上的截距应该是酶的浓度成比例，并提供了一个衡量积极从事与底物的酶。虽然这种方法原则上可以提供证据的存在突发阶段，DIFferent方法需要测量的动力学突发阶段。在许多情况下，的突发阶段是太快了人工搅拌淬火技术测量。在这种情况下，预稳态和单营业额动能（ 即瞬态动能）的方法往往需要快速混合和猝灭反应5按照早的时间点的仪器。在一个稳定状态前的方法，使用高浓度的酶，以便在第一个营业额，形成显着数量的产品。 ，由于多个失误其次观察催化循环（ 即突发如下的线性相位），底物浓度是大于酶浓度（[酶] <[基板]）。隔离事件的酶的活性部位无催化单车，单营业额的条件下被使用。在这种情况下，底物是饱和的酶（E >> S），以使所有的基片将参加我在单笔成交金额，通常会表现出一个单一的指数的时间过程。
如上所述酶表现出一个突发阶段，产品发布（K掉 ）往往限制的稳态阶段的时间过程的速率。产品放行的速度（V SS，浓/时间）可确定从斜坡的线性稳态阶段。活性酶浓度（E）产品发布的速度是需要转换的内在速率常数K掉 = V SS / [E]。重要的是，活性酶的浓度一般低于所测得的蛋白浓度因杂质，处于非活动状态的酶，酶的非生产性基板结合，和所使用的方法，以确定蛋白浓度。活性酶的浓度可以由突发幅度当产品释放缓慢的。因此，推断一个稳定状态的时间当然要零时间提供了一个估计需要从观察到的稳态率计算K掉 （产品发布）的活性酶。
要测量的动力学的突发，预稳态的方法是在第一营业额前发生的线性稳态阶段，要遵循产品的形成。该突发动力学如下酶产品的中间体的形成。一旦反应过程是由酶与底物混合的酶产品的量迅速增加，直至反应达到稳定状态阶段。如果催化比产品的发布更迅速，脉冲串的幅度是等于积极参与的酶和所观察到的指数接近平衡（十一观测值 ）对应的底物向产物的化学转化率，假设反向速率化学是可以忽略不计。
在某些情况下催化CY保鲜干扰预稳态分析，如化学和产品发布率的幅度并不显着不同。在这种情况下，采用酶相对过剩防止绑定到一个单一的营业额酶的催化循环和限制基板基板。因此，第一化学反应步骤可以分离和精确地确定作为一级反应速率常数（k 观测值 ）。此速率常数为k应该是相似的OBS从上述预稳态的方法确定。
这里，我们描述如何将这些动力学的方法，可以用来分析OGG1糖基化酶活性的。
Protocol
Representative Results
Discussion
动力学这里描述的方法，概括的方法来定义基本的动力学常数。如果一个时间过程的产品形成了第一种酶营业额迅速发生双相，然后经化学的一个步骤是在随后的催化失误限速。 OGG1的情况下，可以使用高浓度的酶与限制（S <E)或高(S>É）DNA的浓度测量的第一个营业额。在第一种情况下，该反应是有限的“单一营业额，并提供一定程度的酶的活性位点的催化速率。在后者的情况下，被评估多种?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢朱莉·霍顿博士批判性阅读的手稿和拉金德拉·普拉萨德博士有用的建议和讨论。这项研究最初发表在杂志“生物化学佐佐A 等部分。人，“DNA序列背景效应的糖基化酶活性的人8 -羟基鸟嘌呤DNA糖基化酶。”J Biol Chem的 287，36702-36710（2012）2。这项工作是支持的全部或部分，由美国国立卫生研究院资助计划Z01-ES050158，NIEHS院内研究计划。
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
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