L'état d'équilibre des mesures cinétiques, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d'affaires de l'activité de ADNglycosylase
Summary
des plages de temps pour l'activité glycosylase de 8-oxoguanine ADN glycosylase sont biphasique présentant une salve de formation de produit et une phase de régime permanent linéaire. Utilisant des techniques de trempe de trésorerie, l'éclatement et les taux de régime permanent peut être mesurée, qui correspondent à l'excision de 8 oxoguanine et la libération de la glycosylase de l'ADN du produit, respectivement.
Abstract
Human 8-oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) excise le mutagène oxydatif lésion de l'ADN 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) à partir de l'ADN. Caractérisation cinétique des OGG1 est entrepris pour mesurer les taux d'excision 8 oxoG et version du produit. Lorsque la concentration est inférieure à OGG1 substrat d'ADN, les temps de formation de produit sont biphasique; une phase exponentielle rapide (c. salve) de formation du produit est suivie par une phase de régime permanent linéaire. La salve initial de la formation du produit correspond à la concentration de l'enzyme correctement en prise sur le substrat, et l'amplitude de rafale dépend de la concentration de l'enzyme. La constante de l'éclatement de vitesse de premier ordre correspond à la fréquence intrinsèque de l'excision 8 oxoG et le taux de régime permanent lent mesure le taux de libération du produit (Product DNA dissociation constante de vitesse, k off). Ici, nous décrivons les approches état d'équilibre, pré-état stationnaire, et un seul chiffre d'affaires d'isoler et de mesurer spétapes SPÉCIFIQUE pendant OGG1 cyclisme catalytique. A fluorescent oligonucléotide marqué lésion contenant et OGG1 purifiés sont utilisés pour faciliter les mesures cinétiques précises. Depuis faibles concentrations d'enzymes sont utilisés pour effectuer des mesures en régime permanent, le mélange des réactifs manuel et extinction de la réaction peut être effectuée pour déterminer le taux de régime permanent (k off). En outre, l'extrapolation de la vitesse de régime permanent à un point situé sur l'ordonnée à l'instant zéro indique qu'une salve de formation de produit est survenu au cours de la première rotation (c. ordonnée à l'origine est positif). La constante de temps de la phase de salve exponentiel de vitesse de premier ordre peut être mesurée à l'aide d'une technique de mélange et de refroidissement rapide, qui examine la quantité de produit formé à des intervalles de temps courts (<1 s) avant la phase de régime permanent, et correspond à la vitesse de 8 -oxoG excision (c.-à-chimie). L'étape chimique peut également être mesurée en utilisant une approche unique chiffre d'affaires où le cyclisme catalytique estempêché par l'ADN de substrat de saturation avec l'enzyme (E> S). Ces approches permettent de mesurer les constantes de vitesse élémentaires qui influencent l'efficacité d'élimination d'une lésion de l'ADN.
Introduction
Un milieu aérobie accélère l'instabilité génomique. Une importante lésion de l'ADN promutagène résultant du stress oxydatif est la 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8 oxoG). Cela est dû au potentiel de codage ambigu de 8 oxoG. Human 8 oxoguanine ADN glycosylase (OGG1) est chargé d'initier la réparation par excision de base de 8 oxoG. L'activité glycosylase de OGG1 excise la base de 8 oxoG résultant dans l'ADN de produit avec un site apurinique (AP-site). Une activité de lyase faible de OGG1 peut inciser le site de AP dans certains cas.
Caractérisation cinétique des ADN glycosylases trouve généralement qu'ils présentent des cours à temps biphasique. Après une phase initiale rapide de la formation du produit (c.-à-burst), une phase de régime permanent linéaire est observée 3.1. Ce comportement est révélateur d'une étape à la suite chimie (ie changement de conformation ou la libération du produit) étant de limitation de vitesse au cours de la partie linéaire de l'évolution dans le temps, alors que la fraiseère phase, souvent désigné comme la phase transitoire, correspond à la formation du produit sur le site actif de l'enzyme au cours du premier cycle de la réaction. Lorsque la libération du produit est la limitation du débit au cours de la phase stationnaire, mesures d'activité fournissent une mesure qualitative du produit ADN affinité de liaison, mais ne fournissent pas d'informations concernant la cinétique des événements sur le site actif de l'enzyme (c.-à-chimie). En conséquence, les méthodes d'isoler et de mesurer la phase de la salve de pré-état stationnaire exponentielle sont nécessaires pour sonder événements au cours de la première rotation enzymatique au niveau du site actif 4 de l'enzyme.
Il existe trois approches cinétiques classiques pour caractériser le comportement catalytique de OGG1, (1) l'état d'équilibre, (2) pré-état stationnaire, et (3) un seul chiffre d'affaires. Ces approches se distinguent les unes des autres par la concentration d'enzyme dans le milieu réactionnel et le rapport enzyme à substrat utilisé dans chaque approche. Dans une approche typique d'équilibre,parfois appelé plusieurs cinétique de rotation, de faibles concentrations d'enzyme sont utilisés pour suivre la formation du produit. La concentration du substrat dépasse largement la concentration de l'enzyme de sorte que plusieurs revirements enzymatiques n'affectent pas significativement la concentration du substrat. Dans cette situation, les temps devraient être linéaire et il est souvent difficile de discerner si une explosion a eu lieu au cours du premier chiffre d'affaires en raison de la faible concentration d'enzyme utilisée dans cette approche; noter que l'amplitude de la rafale est équivalente à la concentration de l'enzyme. Cela peut être surmonté en utilisant une concentration de l'enzyme supérieur et en extrapolant l'évolution temporelle linéaire au temps zéro pour détecter si le premier chiffre d'affaires s'est rapidement enzymatique. L'interception sur l'axe des ordonnées (axe des y) doit être proportionnelle à la concentration de l'enzyme et fournit une mesure de l'enzyme activement engagé avec le substrat. Bien que cette approche ne peut en principe fournir des preuves de l'existence d'une phase de la salve, une difrents approche est nécessaire pour mesurer la cinétique de la phase de la salve. Dans de nombreux cas, la phase d'éclatement est trop rapide pour mesurer par des techniques de mélange et d'extinction manuelles. Dans cette situation, cinétique pré-état stable et unique chiffre d'affaires (c.-à-cinétique transitoire) approches nécessitent souvent un instrument de mélange rapide et la trempe de suivre les points de temps au début d'une réaction 5. Dans une approche pré-état d'équilibre des concentrations élevées d'enzyme sont utilisés de telle sorte qu'une quantité importante de produit est formé au cours de la première rotation. Depuis plusieurs revirements sont suivis pour observer cyclisme catalytique (ie la phase linéaire qui suit l'éclatement), la concentration en substrat est supérieure à la concentration de l'enzyme ([enzyme] <[substrat]). Pour isoler des événements sur le site actif de l'enzyme sans vélo catalytique, conditions unique chiffre d'affaires sont utilisés. Dans ce cas, le substrat est saturé avec l'enzyme (E S >>) de telle sorte que la totalité du substrat participeront in le 'chiffre d'affaires unique »et présenteront typiquement un cours à temps simple exponentielle.
Comme indiqué ci-dessus pour les enzymes qui présentent une phase d'éclatement, la libération du produit (k off) limite souvent le taux de la phase stationnaire de l'évolution dans le temps. Le taux de libération du produit (. / Heure V SS, conc) peut être déterminée à partir de la pente de la phase stationnaire linéaire. La concentration d'enzyme active (E) est nécessaire pour convertir le taux de libération du produit à un rythme intrinsèque constante k off = v ss / [E]. Fait important, la concentration de l'enzyme active est généralement inférieure à la concentration mesurée en protéines due aux impuretés, enzyme inactive, enzyme non-productive liés au substrat, et la méthode utilisée pour déterminer la concentration en protéines. La concentration de l'enzyme active puisse être déterminée à partir de l'amplitude de salve lorsque la libération du produit est lente. Ainsi, en extrapolant à un cours à temps l'état d'équilibre àtemps zéro fournit une estimation de l'enzyme active nécessaire pour calculer k off (sortie du produit) du taux d'équilibre observé.
Pour mesurer la cinétique de l'explosion, une approche pré-état d'équilibre est nécessaire de suivre la formation du produit au cours du premier chiffre d'affaires qui se produit avant la phase stationnaire linéaire. La cinétique d'éclatement suit la formation de l'enzyme produit intermédiaire. Une fois que la réaction est initiée par l'enzyme de mélange avec le substrat, la quantité de l'enzyme produit augmente rapidement jusqu'à ce que la réaction atteigne une phase de régime permanent. Si la catalyse est beaucoup plus rapide que la libération du produit, l'amplitude de la rafale est égale à enzyme engagé activement et de l'approche exponentielle observée à l'équilibre (k obs) correspond à la vitesse de conversion chimique du substrat en produit, en supposant que la vitesse inverse de chimie est négligeable.
Dans certains cas, cy catalytiques'accrocher interfère avec une analyse pré-état stationnaire, comme lorsque l'ampleur des taux de la chimie et de la libération du produit ne sont pas significativement différentes. Dans ce cas, employant excès relatif de l'enzyme de substrat empêche les cycles catalytiques et les limites substrat lié avec l'enzyme pour un chiffre d'affaires unique. Par conséquent, la première étape chimique de la réaction peut être isolé et déterminé avec précision que la constante de vitesse de premier ordre (k obs). Cette constante de vitesse devrait être similaire à kobs déterminée à partir de l'approche pré-état stationnaire décrit ci-dessus.
Ici, nous décrivons comment ces approches cinétiques peuvent être utilisés pour analyser l'activité glycosylase de OGG1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les approches cinétiques décrites ici un aperçu des méthodes pour définir des constantes cinétiques élémentaires. Si une évolution dans le temps de formation du produit est biphasique avec le premier chiffre d'affaires enzymatique produisant rapidement, puis une étape après la chimie est limitante pendant revirements catalytiques ultérieurs. Dans le cas de OGG1, le premier chiffre peut être mesurée à l'aide de fortes concentrations d'enzymes avec soit de limitation (S <E) ou haute (S> E)…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Julie K. Horton pour la lecture critique du manuscrit et le Dr Rajendra Prasad des suggestions utiles et des discussions. Des portions de cette recherche ont été publiés à l'origine dans The Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "séquence d'ADN effets de contexte sur l'activité de l'homme Glycosylase ADNglycosylase 8 oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36702-36710 (2012) 2. Ce travail a été financé, en tout ou en partie, par les National Institutes of Health Research Project Grant Z01-ES050158 dans le programme de recherche intra-muros, NIEHS.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
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