Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity
Summary
Corsi a tempo per l'attività glicosilasi di 8-oxoguanine glicosilasi DNA sono bifasica esibendo una raffica di formazione del prodotto e una fase a regime lineare. Utilizzando tecniche di quench-flow, lo scoppio e le tariffe di stato stazionario possono essere misurati, che corrispondono ad escissione di 8-oxoguanine e rilascio della glicosilasi dal DNA prodotto, rispettivamente.
Abstract
Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) accise il mutageno ossidativo lesione del DNA 8-oxo-7 ,8-dihydroguanine (8-oxoG) dal DNA. Caratterizzazione cinetica di OGG1 è intrapresa per misurare i tassi di escissione 8-oxoG e rilascio del prodotto. Quando la concentrazione è inferiore OGG1 DNA substrato, andamento nel tempo della formazione del prodotto siano bifasici, una rapida fase esponenziale (cioè burst) di formazione del prodotto è seguita da una fase di stato lineare. Il burst iniziale di formazione del prodotto corrisponde alla concentrazione di enzima agganciati bene sul substrato, e l'ampiezza scoppio dipende dalla concentrazione di enzima. La costante del burst di velocità di primo ordine corrisponde alla frequenza intrinseca di escissione 8-oxoG e il tasso di stato stazionario lento misura il tasso di rilascio del prodotto (prodotto di DNA tasso costante di dissociazione, k off). Qui, descriviamo approcci allo steady-state, pre-steady-state, e single-fatturato di isolare e misurare sppassi ecific durante OGG1 ciclismo catalitico. Un oligonucleotide marcato fluorescente lesione contenente OGG1 purificati e sono utilizzati per facilitare misurazioni cinetiche precise. Poiché le concentrazioni enzimatiche basse sono utilizzate per effettuare misurazioni di stato stazionario, manuale miscelazione dei reagenti e tempra della reazione può essere eseguita per accertare il tasso di stato stazionario (k off). Ulteriormente, estrapolazione del tasso steady state ad un punto in ordinata al tempo zero indica che un burst di formazione del prodotto è verificato durante la prima turnover (cioè intercetta è positivo). La costante della fase di scoppio esponenziale di velocità di primo ordine può essere misurata usando una tecnica di miscelazione e tempra rapida che esamina la quantità di prodotto formato ad intervalli di tempo brevi (<1 sec) prima della fase stazionaria e corrisponde al tasso di 8 -oxoG escissione (cioè chimica). Il passo chimica può anche essere misurata utilizzando un approccio a singolo giro d'affari in cui il ciclismo catalitica èimpedito saturando DNA substrato con l'enzima (E> S). Questi approcci possono misurare le costanti di velocità elementari che influenzano l'efficienza di rimozione di una lesione del DNA.
Introduction
Un ambiente aerobico affretta instabilità genomica. Un grave lesione del DNA promutagena che si realizza derivanti da stress ossidativo è 7,8-diidro-8-oxoguanine (8-oxoG). Ciò è dovuto al potenziale codifica ambiguo di 8-oxoG. Umana 8-oxoguanine DNA glicosilasi (OGG1) è responsabile dell'avvio base di riparazione per escissione di 8-oxoG. L'attività glicosilasi di OGG1 accise della base 8-oxoG conseguente DNA prodotto con un sito apurinico (AP-site). Una debole attività liasi di OGG1 può incidere la AP-site in alcuni casi.
Caratterizzazione cinetica di glycosylases DNA trova generalmente tale da presentare i corsi tempo bifasico. Dopo una fase iniziale di rapida formazione del prodotto (cioè burst), una fase di stato lineare si osserva 1-3. Questo comportamento è indicativo di un passo successivo di chimica (cioè cambiamento conformazionale o rilascio di prodotto) essendo limitante durante la porzione lineare del corso di tempo, mentre la fresast fase, spesso definito come la fase transitoria, corrisponde alla formazione del prodotto presso il sito attivo dell'enzima durante il primo ciclo della reazione. Quando rilascio del prodotto è il tasso di limitare durante la fase a regime, misure di attività forniscono una misura qualitativa del DNA prodotto affinità di legame, ma non forniscono informazioni cinetica relativa eventi presso il sito attivo dell'enzima (cioè chimica). Pertanto, sono necessari metodi per isolare e misurare la fase di pre-scoppio stazionario esponenziale per sondare eventi durante la prima turnover enzimatica a 4 sito attivo dell'enzima.
Ci sono tre approcci cinetici standard per caratterizzare il comportamento catalitico di OGG1, (1) allo stato stazionario, (2) pre-steady-state, e (3) un solo fatturato. Questi approcci differiscono l'uno dall'altro per la concentrazione di enzima nella miscela di reazione e l'enzima di rapporto substrato utilizzato in ogni approccio. In un tipico approccio di stato stazionario,talvolta indicato come multipli cinetica fatturato, basse concentrazioni di enzima sono usati per seguire formazione del prodotto. La concentrazione del substrato supera notevolmente la concentrazione dell'enzima modo che più fatturati enzimatiche non influenzano significativamente la concentrazione del substrato. In questa situazione, i corsi tempo dovrebbe essere lineare e spesso è difficile discernere se un burst avvenute nella prima turnover causa della bassa concentrazione di enzima usato in questo approccio, si noti che l'ampiezza di scoppio è equivalente alla concentrazione dell'enzima. Questo può essere superato utilizzando una concentrazione dell'enzima superiore ed estrapolando il decorso lineare per tempo zero per rilevare se il primo turnover enzimatico verificato rapidamente. L'intercetta sulle ordinate (asse y) deve essere proporzionale alla concentrazione dell'enzima e fornisce una misura dell'enzima attivamente impegnati con il substrato. Sebbene questo approccio può in linea di principio fornire prova dell'esistenza di una fase di scoppio, una differenti approccio è necessario per misurare la cinetica della fase di scoppio. In molti casi la fase di scoppio è troppo veloce per misurare con tecniche di miscelazione e spegnimento manuali. In questa situazione, cinetico pre-stazionario e single-turnover (cioè cinetica transitoria) avvicina spesso richiedono uno strumento rapida miscelazione e tempra a seguire primi punti di tempo di una reazione 5. In un approccio pre-stazionario alte concentrazioni di enzima vengono utilizzati in modo che una quantità significativa di prodotto si forma durante la prima turnover. Poiché più fatturati vengono seguiti per osservare ciclismo catalitico (cioè la fase lineare che segue il burst), concentrazione del substrato è maggiore della concentrazione dell'enzima ([enzima] <[substrato]). Per isolare eventi al sito attivo dell'enzima senza il ciclo catalitico, le condizioni single turnover sono utilizzati. In questo caso, il substrato è saturo di enzima (E >> S) in modo che tutto il substrato parteciperanno in la 'single fatturato' e in genere mostrano un corso a tempo singolo esponenziale.
Come notato sopra per gli enzimi che esibiscono una fase di scoppio, rilascio del prodotto (k off) spesso limita la velocità della fase di stato del corso tempo. Il tasso di rilascio del prodotto (. / Ora v ss, conc) può essere determinato dalla pendenza della fase di stato lineare. La concentrazione di enzima attivo (E) è necessaria per convertire la velocità di rilascio del prodotto per una costante di velocità intrinseca dove k off = v ss / [E]. È importante sottolineare che la concentrazione di enzima attivo è tipicamente inferiore alla concentrazione misurata proteina causa di impurità, enzima inattivo, enzima non legato a produttivamente substrato, e il metodo utilizzato per determinare la concentrazione di proteina. La concentrazione di enzima attivo può essere determinata dalla ampiezza scoppio quando rilascio del prodotto è lenta. Così, estrapolando un corso a tempo di stato stazionario pertempo zero fornisce una stima di enzima attivo necessari per calcolare k off (rilascio del prodotto) dal tasso di steady-state osservato.
Per misurare la cinetica di scoppio, un approccio pre-stazionario è necessario seguire la formazione del prodotto durante la prima rotazione che avviene prima della fase di stato lineare. La cinetica di burst segue la formazione di enzima prodotto intermedio. Una volta che la reazione è avviata da miscelazione con substrato enzimatico, la quantità di enzima prodotto aumenta rapidamente finché la reazione raggiunge una fase di crociera. Se catalisi è molto più rapida di quella di rilascio del prodotto, l'ampiezza del burst è uguale enzima attivamente impegnati e l'approccio esponenziale osservata all'equilibrio (k obs) corrisponde al tasso di conversione chimica del substrato a prodotto, ipotizzando che il tasso inverso chimica è trascurabile.
In alcuni casi cy cataliticoaggrappano interferisce con un'analisi pre-steady-state, ad esempio quando le grandezze delle tariffe per la chimica e la release del prodotto non sono significativamente differenti. In questo caso, impiegando enzima eccesso rispetto al substrato impedisce ciclismo catalitica e limiti substrato legato con enzima per un singolo turnover. Pertanto, la prima fase della reazione chimica può essere isolato e accuratamente determinato come la costante di velocità di primo ordine (k obs). Questa costante tasso dovrebbe essere simile a K obs determinata da un approccio pre-stazionario sopra descritto.
Qui si descrive come questi approcci cinetici possono essere utilizzati per analizzare l'attività glicosilasi di OGG1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli approcci cinetici descritti qui delineare i metodi per definire le costanti cinetiche elementari. Se un corso di tempo di formazione del prodotto è bifasica con il primo turnover enzimatico verificano rapidamente, poi un passo dopo chimica è limitante durante le successive rotazioni catalitici. Nel caso del OGG1, primo turnover può essere misurata usando concentrazioni elevate di enzimi sia con limitatore (S <E) o alto (S> E) concentrazioni di DNA. Nel primo caso, la reazione è limitata ad un 'singolo …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Julie K. Horton per la lettura critica del manoscritto e il Dr. Rajendra Prasad per utili suggerimenti e discussioni. Porzioni di questa ricerca sono stati originariamente pubblicati nel Journal of Biological Chemistry, Sassa A et. al., "sequenza di DNA effetti di contesto sulla attività Glycosylase di Human Glycosylase DNA 8-oxoguanine." J Biol Chem. 287, 36.702-36.710 (2012) 2. Questo lavoro è stato sostenuto, in tutto o in parte, dal National Institutes of Health Research Project di Grant Z01-ES050158 nel programma di ricerca intramurale, NIEHS.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
Riferimenti
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