DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정
Summary
8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.
Abstract
인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 DNA에서 돌연변이 산화 DNA 병변 8 – 옥소-7 ,8-dihydroguanine (8 oxoG를) 소비세. OGG1의 운동 특성은 8 oxoG 절단 및 제품 릴리스의 속도를 측정하기 위해 실시된다. OGG1 농도가 기질 DNA보다 낮은 경우, 제품 형성의 시간 코스는 이상성이다, 제품 형성의 급속한 지수 단계 (즉 버스트) 선형 안정 상태 단계가옵니다. 제품 형성의 초기 버스트가 제대로 기판에 종사하는 효소의 농도에 해당하고 버스트 진폭은 효소의 농도에 따라 달라집니다. 버스트의 정수 1 차 비율은 8 oxoG 절단의 고유 속도에 대응하고 느린 정상 상태의 속도는 제품 릴리스 (일정한 제품 DNA 분리 속도, K 해제)의 속도를 측정합니다. 여기, 우리는 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 접근법 SP를 분리하고 측정하는 기술OGG1 촉매 순환하는 동안 ecific 단계. 형광 표지 병변을 포함하는 올리고 뉴클레오티드 및 정제 OGG1은 정확한 운동 측정을 용이하게하기 위해 사용됩니다. 낮은 효소 농도가 정상 상태 측정, 반응 시약의 혼합 수동 및 냉각을 만드는 데 사용되기 때문에 정상 상태 속도 (K 해제) 확인하기 위해 수행 할 수 있습니다. 또한, 시간 제로의 좌표에 점으로 정상 상태 속도의 추정 제품 형성의 버스트는 첫 번째 회전율 (즉, y 절편이 양수) 동안 발생했음을 나타냅니다. 지수 버스트 위상 상수 1 차 속도는 정상 상태 단계 전에 짧은 시간 간격 (<1 초)에 형성된 제품의 양을 검사하고 8의 비율에 해당하는 빠른 혼합 및 냉각 기술을 사용하여 측정 할 수있다 – oxoG 절제 (즉, 화학). 촉매 순환이 어디에 화학적 단계는 단일 매출 방식을 사용하여 측정 할 수있다효소 (E> S)과 포화 기판 DNA에 의해 못했습니다. 이 방법은 DNA 병변의 제거 효율에 영향을 미치는 초등학교 속도 상수를 측정 할 수 있습니다.
Introduction
호기성 환경 게놈 불안정성을 서둘러. 산화 스트레스로 인한 주요 promutagenic DNA 병변은 7,8 – 디 하이드로-8-oxoguanine (8 oxoG)입니다. 이 8 oxoG의 모호한 코딩 가능성 때문이다. 인간의 8 oxoguanine DNA glycosylase (OGG1)는 8 oxoG의 기본 절단 복구를 시작 책임이 있습니다. OGG1의 glycosylase 활동 apurinic 사이트 (AP 현장)과 제품 DNA의 결과로 8 oxoG베이스 소비세. OGG1의 약한 분해 효소 활동은 어떤 경우에 AP-사이트를 절개 할 수 있습니다.
DNA의 glycosylases의 운동 특성은 일반적으로 그들이 이상성 시간 과정을 나타내는 것을 발견. 제품 형성의 초기 빠른 단계 (즉, 버스트) 한 후, 선형 정상 상태 위상은 1-3 관찰된다. 이 동작은 가시 반면, 화학 (즉, 구조적 변화 또는 제품 릴리스) 시간 코스의 직선 부분을 진행하는 동안 속도 제한되고 다음 단계의 지표입니다종종 과도 단계로 불리는 세인트 단계, 반응의 첫 번째주기 동안 효소 활성 부위의 제품 형성에 해당합니다. 제품 출시가 정상 상태 단계 속도 제한되면 활동 측정 제품 DNA 결합력의 질적 측정을 제공하지만, 효소 활성 부위 (즉, 화학)에서 이벤트에 관한 운동 정보를 제공하지 않습니다. 따라서, 지수 전 정상 상태 버스트 위상을 분리하고 측정하는 방법은 효소의 활성 사이트 4에서 처음 효소 매출액 동안 이벤트를 조사하기 위해 필요합니다.
(1) 정상 상태 (2) 전 정상 상태, (3) 단일 매출 OGG1의 촉매 동작을 특징 짓는 세 가지 표준 운동 방법이 있습니다. 이러한 방법은 반응 혼합물에있는 효소의 농도와 각 방법의 활용 기판의 비 효소 서로 다릅니다. 일반적으로 정상 상태 접근,때로는 여러 회전율 반응 속도라고도 효소의 낮은 농도는 제품의 형성을 따라하는 데 사용됩니다. 여러 효소 회전율이 크게 기질 농도에 영향을주지 않도록 기질 농도가 크게 효소 농도를 초과합니다. 이 상황에서, 시간 코스는 직선이어야하며, 그 폭발이 방법에 사용되는 낮은 효소 농도에 의한 최초의 매출액 동안 발생했는지 여부를 식별하는 것이 어려운, 참고 버스트 진폭이 효소의 농도에 해당합니다. 이 높은 효소 농도를 사용하여 첫 번째 효소 매출이 빠르게 발생 여부를 감지하는 시간 제로에 선형 시간 과정을 외삽하여 극복 할 수 있습니다. 좌표에 절편 (y 축)은 효소 농도에 비례 적극적으로 기판 종사하는 효소의 측정을 제공합니다. 이 방법은 원칙적으로 버스트 위상의 존재에 대한 증거, DIF를 제공 할 수 있지만,ferent 접근 방식은 버스트 단계의 반응 속도를 측정하기 위해 필요합니다. 많은 경우에 버스트 위상은 수동 혼합 및 냉각 기술로 측정하기에는 너무 빠릅니다. 이 상황에서, 이전 정상 상태 및 단일 매출 운동 (즉, 일시적인 운동)은 종종 반응을 5 초 시점을 따라 급속 혼합 및 냉각 장비를 필요로 접근한다. 전 정상 상태 접근 방식 효소의 높은 농도는 제품의 상당한 양의 첫 매출이 형성되도록 사용됩니다. 여러 개의 턴 오버가 촉매 순환 (즉, 버스트를 다음과 선형 위상) 관찰하기 위해 다음되기 때문에, 기질 농도는 효소 농도 ([효소] <[기질])보다 큽니다. 촉매 순환하지 않고 효소의 활성 사이트에서 이벤트를 분리하려면 단일 매출 조건을 활용하고 있습니다. 이 경우, 기판은 기판의 내가 참여 할 수 있도록 (E >> S) 효소 포화N '단일 매출'과는 일반적으로 단일 지수 시간 경과를 전시 할 예정이다.
버스트 위상, 제품 릴리스 (K 오프) 전시 효소에 대해 위에서 언급 한 바와 같이 종종 시간 코스의 정상 상태 단계의 속도를 제한합니다. 제품 출시 (V SS, 진한. / 시간)의 비율은 선형 정상 상태 위상의 기울기에서 확인할 수 있습니다. 활성 효소의 농도 (E)는 일정한 고유 속도로 제품 릴리스의 속도를 변환하는 데 필요한 곳에 K 오프 = V SS / [E]. 중요한 것은, 활성 효소 농도는 불순물에 의한 측정 단백질 농도, 비활성 효소, 효소가 아닌 생산적으로 기판에 바인딩 단백질 농도를 결정하는 데 사용하는 방법보다 일반적으로 낮다. 제품 출시 속도가 느린 경우 활성 효소 농도는 버스트 진폭에서 확인할 수 있습니다. 따라서,에 대한 정상 상태 시간 과정을 외삽시간 제로 관찰 된 정상 상태 속도에서 K 오프 (제품 출시)를 계산하는 데 필요한 활성 효소의 견적을 제공합니다.
버스트의 반응 속도를 측정하기 위해, 사전에 정상 상태 방법은 선형 안정 상태 단계 이전에 발생하는 첫 번째 매출 중 제품의 형성을 따를 필요가있다. 버스트 속도론은 효소 제품 중간의 형성을 다음과 같습니다. 반응이 기판과 혼합 효소에 의해 시작하면 반응이 정상 상태 단계에 도달 할 때까지, 효소 제품의 양이 급격히 증가합니다. 촉매 훨씬 더 빠른 제품 출시보다는 더 많은 것 인 경우에, 버스트의 진폭은 가정 제품 기판의 화학 변환의 속도에 해당하는 평형에 적극적으로 관여 효소와 관찰 지수 방식 (K OBS)와 동일합니다 그 반대 비율 화학 무시할 수 있습니다.
어떤 경우에는 촉매 CY에서집착은 화학 제품 출시 가격의 진폭은 유의 한 차이가없는 경우로 사전에 정상 상태 분석을 방해합니다. 이 경우, 기판에 과도한 효소 상대를 채용하는 것은 하나의 회전율 효소 결합 촉매 순환 및 제한 기판을 방지 할 수 있습니다. 1 차 속도 상수 (K OBS)로 따라서, 반응의 첫 번째 화학적 단계는 분리 할 수 있으며 정확하게 결정했다. 일정이 비율은 OBS K 유사한 위에서 설명한 사전 정상 상태 접근법을 결정해야한다.
여기에서 우리는이 운동 방법은 OGG1의 glycosylase 활동을 분석하는 데 사용할 수있는 방법에 대해 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
운동 방법은 초등학교 운동 상수를 정의하는 방법을 설명 여기에 설명. 제품 형성의 시간 코스의 첫 번째 효소 매출이 빠르게 발생과 이상성 경우, 화학 후 단계 이후의 촉매 턴 오버 중에 속도 제한됩니다. OGG1의 경우, 최초의 회전율도 (S <E) 또는 (S> E 높음) DNA의 농도를 제한하는 높은 효소 농도를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 첫 번째 경우, 반응은 '단일 매출'로 제한되며 효소의 활?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 제안과 토론 원고 박사 라젠 드라 프라 사드의 중요한 읽기 박사 줄리 K. 호튼 감사합니다. 본 연구의 일부는 원래 생물 화학, 사사 등의 저널에 발표되었다. 알., "인간 8 Oxoguanine DNA의 Glycosylase의 Glycosylase 활동에 DNA 시퀀스 컨텍스트 효과."J BIOL 화학. 287, 36702-36710 (2012) 2. 이 작품은 교내 연구 프로그램에 건강 연구 프로젝트 그랜트 Z01-ES050158의 국립 연구소, NIEHS에 의해 전체 또는 일부를 지원 하였다.
Materials
| Reagent/Material | |||
| 5′-6-FAM labeled oligonucleotides containing a single 8-oxoG | Eurofins MWG Operon | 5′-P32 radiolabeled oligonucleotides can be used as well. Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| Unlabeled oligonucleotides (complementary strand) | Eurofins MWG Operon | Polyacrylamide gel purification grade is recommended. | |
| 1 ml BD Luer Lock disposable syringe | BD Medical | 309628 | Lue Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| 10 ml BD Luer Lock disposable syringe | BE Medical | 309604 | Luer Lock disposable syringe from other vendors can be used as well. |
| Equipment | |||
| Circulating water bath | Any vender | ||
| RQF-3 Rapid Quench-Flow Instrument | KinTek Corporation | Rapid Quench-Flow Instrument from other vendors can be used as well. | |
| Typhoon Phosphorimager 8600 | GE Healthcare Life Sciences | Imager from other vendors can be used as well. | |
| KaleidaGraph | Synergy Software |
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