I denne artikkelen beskriver vi full eksperimentell prosedyre for å rekonstruere, med høy oppløsning, den fine hjernen anatomi fluorescensmerkede mus hjerner. Den beskrevne protokollen omfatter prøveopparbeidelse og clearing prøven monterings for bildebehandling, data post-prosessering og multi-skala visualisering.
Forstå arkitekturen i hjernen hos pattedyr ved encellede oppløsning er en av de viktigste spørsmålene i nevrovitenskap. Men kartlegging neuronal soma og prognoser gjennom hele hjernen er fortsatt utfordrende for bildebehandling og datahåndteringsteknologier. Faktisk, makroskopiske volumer må rekonstrueres med høy oppløsning og kontrast i en rimelig tid, produsere datasett i Terabyte serien. Vi har nylig demonstrert en optisk metode (konfokal lys ark mikroskopi, CLSM) i stand til å skaffe mikron-skala rekonstruksjon av hele mus hjerner merket med forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP). Kombinere lys ark belysning og confocal deteksjon, tillater CLSM dypt bildebehandling inne makroskopiske ryddet prøvene med høy kontrast og hastighet. Her beskriver vi den komplette eksperimentell rørledningen for å få omfattende og lesbar bilder av hele mus hjerner merket med fluorescerende proteiner. Clearing og monterings procedures er beskrevet, sammen med fremgangsmåten for å utføre en optisk tomografi på sin hele volumet ved å anskaffe mange parallelle tilstøtende stabler. Vi viste bruken av åpen kildekode skreddersydde programvareverktøy som gjør det mulig søm av flere stabler og multi-oppløsning data navigasjon. Til slutt illustreres vi noen eksempel på hjernekart: cerebellum fra en L7-GFP transgen mus, i hvilken alle Purkinje celler er selektivt merkes, og hele hjernen fra en thy1-GFP-M-mus, karakterisert ved et vilkårlig tynt neuronal merking.
Sammenlignet med vår forståelse av molekylære og cellulære mekanismene bak hjernens funksjon, ser vår kunnskap om fin neuroanatomy fortsatt i sin barndom en. Faktisk, vi mangler fortsatt omfattende kart over plasseringen av nevronale somata eller langtrekkende anslag i hele hjernen. Egentlig er mange teknologiske innsats viet til rekonstruere musen hjernen med mikroskopisk oppløsning. Optiske metoder basert på serie seksjonering av harpiks-embedded prøver, som Knife-Edge Scanning Mikros (KESM) 2, Micro-Optical Seksjonering Tomography (MOST) 3 og fluorescens-MOST (fMOST) 4, kan gi sub-micron tredimensjonal oppløsning avbildning av hele mus hjerner. Imidlertid er den totale tiden som er nødvendig for utarbeidelse og avbildning av en enkelt prøve av rekkefølgen på flere uker, noe som begrenser den praktiske anvendelsen av slike metoder. En annen teknikk basert på serie seksjonering (men uten klister embedding), Serial To-Photon tomografi (STP) 5, gir høy tredimensjonal oppløsning bildebehandling. Imidlertid har denne teknikken er påvist i hele mus hjerner bare med en svært sparsom prøvetaking, samle en seksjon hver 50 mikrometer fem, og så vidt vi vet STP ikke har produsert enda en full-sampling rekonstruksjon av en murine hjerne.
En avansert optisk metode for å rekonstruere hele prøvene i tre dimensjoner i høy hastighet er lett ark mikros 6.. I denne optiske ordningen prøven er belyst med et tynt ark av lys og fluorescensemisjonen samles langs en akse perpendikulær på belysningsplanet. På denne måten bare i-fokus fluorophores er spent og det er mulig å oppnå optisk seksjonering i bredt felt konfigurasjon, noe som garanterer høy bildefrekvens. Når dette kombineres til å avskjære protokoller basert på substitusjon av vann med en brytningsindekstilpassende væske 7, har lys ark mikros blitt påførtmakroskopiske prøver, som hele mus hjerner åtte. Men prøven-indusert lysspredning, noe som påvirker selv ryddet prøver, forringer lys ark fører til eksitasjon av ut-av-fokus fluoroforene som legger en samlet uskarphet til de oppkjøpte bildene.
For å selektivt samle bare i-fokus fotoner, vi nylig kombinert lys ark belysning til en confocal deteksjon ordningen ni. I konfokal lys ark mikroskopi (CLSM), er ute av fokus og spredte fotoner avvist av en lineær romlig filter (slit) før deteksjon (Figur 1). For å oppnå konfokal drift i lys ark-arkitektur, blir lys som produseres ved hjelp av en skannelinje, og en de-skannesystem i registreringsbanen skaper et statisk bilde av magnetisering avsøkningslinjen ved stedet for slissen. En tredje skannesystem rekonstruerer et todimensjonalt bilde på kameraets sensor. CLSM gir en 100% kontrastoppladning i ryddet mushjerner med hensyn til konvensjonelle lys ark mikroskopi, og samtidig opprettholde en 10 Hz bildefrekvens. Med CLSM er det mulig å rekonstruere hele mus hjerner med oppløsning av 2 mikrometer i XY og 9 mikrometer i Z, og med tilstrekkelig kontrast å skjelne enkelt fluorescensmerkede neuroner.
I denne artikkelen beskriver vi den eksperimentelle rørledningen for å rekonstruere en musehjerne med CLSM. Aldehyd-fast mus hjerner er dehydrert i en gradert serie av peroksyd-fritt tetrahydrofuran og deretter tømt i peroksyd-fri dibenzyl-eter (figur 2), etter den protokoll som er utviklet av Becker et al. 10. Den erte prøven blir deretter omhyggelig montert på en tippet plate og plassert i bildekammer av en skreddersydd konfokal lys ark mikroskop. Prøven kan monteres direkte ved å dyppe den på en spiss på platen (figur 3a), alternativt kan limes på en plate av erte agarosegel (figur3b) eller plassert i hulrommet i et begerglass fremstilt av erte agarosegel (figur 3c). En optisk tomografi av hele hjernen blir deretter utført, så mange parallelle tilstøtende stabler er anskaffet for å dekke hele hjernen volum (figur 4). En pre-tomografi sampling, som frembringer en grov kart av prøven stilling og form, garanterer at avbildning utføres bare i volumet okkupert av prøven. De tomografi stabler senere blir sydd sammen med skreddersydd programvare og lagret i en multi-oppløsning hierarkisk ordning 11. Mus hjerner kan etter hvert bli utforsket med prototypal multi-oppløsning Google Maps-lignende visualiseringsprogramvare. Begge disse programvareinstrumenter er integrert som plugins i åpen kildekode-plattform Vaa3D 12.
Vi endelig vise representative bilder av mus hjerner for å vise mulighetene den beskrevne eksperimentell rørledningen i å studere fin murine neuroanatomy.
CLSM kombinert med kjemisk clearing representerer et kraftig verktøy for å studere nevroanatomi av hele mus hjerner merket med fluorescerende prober, enten proteiner eller syntetiske fargestoffer. Siden lyset slippes utenfor fokusplanet er blokkert av en fysisk romlig filter, er høy kontrast bildebehandling mulig også i tykke prøver, og samtidig opprettholde den høye bildefrekvens som er typisk for lys ark arkitektur.
Den viktigste saken for å forholde seg til når du bruker de beskrevne metodene er å øke den kontrasten. Faktisk er det tilgjengelige signal reduseres både ved kjemiske og optiske faktorer. Fra kjemisk synspunkt, kan clearing prosedyrer basert på organisk løsemiddel slukke utslipp fra fluoriserende proteiner og andre fluorescerende fargestoffer 7. Filtrering av oppløsningsmidlet for å fjerne peroksyder, som beskrevet av Becker et al. 10, gjør det mulig å opprettholde et godt nivå av fluorescens også i løsemiddelerte vev. Published vannbaserte avregningsmetoder 14 ikke reduserer fluorescens effektivitet, men resultere i dårligere gjennomsiktighet når du arbeider med hele murine hjerner, i hvert fall med lineære optiske teknikker.
På den annen side, i øyeblikket er det ingen kommersielle mål med lang arbeidsavstand korrigert for høy brytningsindeks (n ≈ 1,56) clearing løsninger som brukes. Således brytningsindeksen mismatch mellom mediet hvori prøven er neddykket, og utformingen av en av målet gir opphav til sterke sfæriske aberrasjoner. Foruten å redusere oppløsningen av mikroskopet, slike avvik fører til en reduksjon av bildeintensitet og kontrast, da lys blir spredt på et større område. Mulige løsninger på dette problemet inkluderer bruk av adaptiv optikk 15 og / eller statiske asfæriske correctors.
Enhver forbedring i bildekontrast og intensitet lett påvirker også avbildningshastighet, siden en korteretegration tid per bilde kan velges. I det øyeblikk CLSM har råd til en avbildningshastighet på omtrent 10 mikrometer 6 3 / sek, med en kameraeksponeringstiden på 100 msek 9.. Ved denne hastigheten tar det 1-3 dager for å avbilde et hele musehjerne, avhengig av prøvens størrelse. Selv om ingen signifikant reduksjon i bildekvalitet er observert gjennom en slik lang bildebehandling økt, hovedsakelig på grunn av den iboende lav fotobleking av lys ark belysning 6, den lange tiden som er nødvendig for å image et enkelt muse hjernen kan i praksis redusere anvendelsen av CLSM. En 10-gangers økning i systemeffektivitet, kombinert med bruk av en høyhastighetskamera for deteksjon, vil redusere bilde tid til flere timer, slik at en rutinemessig bruk av den beskrevne protokoll.
Til tross for alle de ovennevnte begrensninger, CLSM bildebehandling koblet til kjemisk rengjøring av vev tillatelser til å rekonstruere hele mus hjerner med mikron-skala oppløsning på mindre enn enuke. Andre optiske metoder for hele hjernen bildebehandling råd til høyere oppløsning enn CLSM, men til prisen av lengre forberedelse og / eller bilde tid 2-4, eller av en sparsom z prøvetaking fem.
Metodene som beskrives i denne artikkelen, kan anvendes i kombinasjon med forskjellige strategier for fluorescerende merking: transgene dyr som uttrykker fluorescerende proteiner i valgte undergrupper, neuronale viral transfeksjon, intraparenchymal fargestoff injeksjon, etc. I praksis kan alle flekker strategier foranstående dyreoffer er kompatible med CLSM . Faktisk har post-mortem fluorescerende merking av hele mus hjerner ikke blitt vist til nå, uansett, hvis en slik type flekker ville være mulig i nær fremtid, antall prøver som kan bli rekonstruert med CLSM vil bli mye større, potensielt inkludert menneskelige hjerne vev.
I konklusjonen, konfokal lys ark mikroskopi brukes i kombinasjon med tissaksøke clearing og multi-oppløsning data management kan tillate forskere å rekonstruere og analysere makroskopiske prøver med oppløsning i micron skala, med teknologiske tiltak som er godt på hånden av de fleste laboratorier. Potensielle anvendelser av CLSM er selvfølgelig ikke begrenset til nevrovitenskap, men spenner over alle forskningsfelt hvor lys ark mikroskopi har allerede blitt brukt, som embryogenese 16,17 og anatomi av små dyr 18.
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som fører til disse resultatene har fått støtte fra EU sjuende rammeprogram (FP7/2007-2013) etter tilskuddsavtaler n. 228334 og 241526. Dette forskningsprosjektet har vært også støttet av Human Frontier Science Program forskningsstipend (RGP0027/2009), og etter det italienske departementet for utdanning, universitet og forskning innenfor rammen av flaggskip-prosjektet Nanomax og av den italienske helsedepartementet i rammen av "Stem Cells Utlysning". Denne forskningen er utført i rammen av forskningsvirksomhet av ICON stiftelse som støttes av "Ente Cassa di risparmio di Firenze".
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |