Transplantes faciais em<em> Xenopus laevis</em> Os embriões
Summary
Uma técnica para o transplante "Extreme Anterior Domain" tecido facial entre embriões de Xenopus laevis foi desenvolvido. Tecidos podem ser movidos de um gene de expressão fundo em outra, permitindo o estudo das necessidades locais para o desenvolvimento craniofacial e sinalização para as interações entre as regiões faciais.
Abstract
Defeitos congênitos craniofaciais ocorrer em 1 em cada 700 nascidos vivos, mas etiologia raramente é conhecido devido à compreensão limitada do desenvolvimento craniofacial. Para identificar onde vias de sinalização e tecidos agir durante padronização do rosto em desenvolvimento, a técnica "transplante de face" foi desenvolvido em embriões de rã Xenopus laevis. Uma região de tecido facial presuntivo (o "extremo anterior Domain" (EAD)) é removido a partir de um embrião dador na fase tailbud, e transplantado para um embrião hospedeiro da mesma fase, a partir do qual a região equivalente foi removido. Isto pode ser usado para gerar uma cara quimérico onde o tecido do hospedeiro ou de doadores tem uma perda ou ganho de função no gene, e / ou inclui um rótulo linhagem. Após a cura, o resultado do desenvolvimento é monitorizada, e indica os papéis da via de sinalização dentro do doador ou tecidos hospedeiros circundantes. Xenopus é um modelo útil para o desenvolvimento de cara, tal como a região facial é grande e prontamente umccessible para micromanipulação. Muitos embriões podem ser analisadas, durante um curto período de tempo já que o desenvolvimento ocorre rapidamente. Constatações do sapo são relevantes para o desenvolvimento humano, uma vez que os processos craniofaciais aparecer conservadas entre Xenopus e mamíferos.
Introduction
Para entender os mecanismos subjacentes defeitos craniofaciais congênitos 1-2, tecidos importantes e suas contribuições de sinalização durante o desenvolvimento craniofacial devem ser identificados. No sapo Xenopus laevis, parte do rosto, incluindo a boca e as narinas forma do "Extreme Anterior Domain" (EAD), onde ectoderma e endoderma estão diretamente justapostas 3-4. A EAD também actua como um centro de sinalização para influenciar os tecidos circundantes, incluindo a crista neural craniano, que forma as mandíbulas e outras regiões da face 5. Para identificar genes que contribuem para a função de EAD, uma técnica de "transplante de face 'foi desenvolvido, em que o tecido transplantado de um dador para um embrião hospedeiro, após a remoção da região do hospedeiro correspondente. Seguindo o transplante, resultando desenvolvimento facial é avaliada. Assim, os efeitos da perda de função (LOF) ou ganho de função (GOF) de um gene específico em EAD são analisadas localmente, onde o restante do head e corpo é formado por um tecido do tipo selvagem. O transplante recíproco pode ser realizado, em que o tecido do tipo selvagem é transplantado em embriões com LOF mundial ou GOF em genes específicos. Transplante tem sido frequentemente usado em Xenopus e pintainho estuda 6. Por exemplo, o transplante de Xenopus abordou indução homogenetic neural, lente e competência neural, e migração da crista neural 7-10. Quail-chick enxerto quimérico analisou o desenvolvimento da placa neural anterior, cume neural anterior, crista neural, e os ossos cranianos 11-14. Esta é a primeira técnica de transplante para o estudo do desenvolvimento craniofacial em Xenopus. Esta técnica tem demonstrado um novo papel para os inibidores de Wnt Frzb1 e crescentes na regulação da formação de membrana basal na boca presuntivo 5. Xenopus laevis é um modelo ideal para o estudo do desenvolvimento craniofacial como embriões são grandes, desenvolver externamente, umand o rosto é facilmente visível, permitindo micromanipulação e imagem do desenvolvimento. Mecanismos subjacentes ao desenvolvimento facial aparecem conservado, indicando que as descobertas feitas no sapo fornecer uma visão sobre o desenvolvimento humano 4,15-16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Etapas críticas e limitações: O procedimento de transplante de rosto EAD é tempo e trabalho intensivo. Requer prática, mãos firmes, e destreza para aperfeiçoar. O protocolo de transplante de rosto depende da capacidade do pesquisador para remover de forma eficiente e tecidos para transplante. Se alguém leva muito tempo para inserir o transplante no rosto do anfitrião, o rosto de acolhimento começará a se contrair e curar. Pinça pode ser utilizado para expandir delicadamente a região facial. No entant…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Radek Sindelka por seu auxílio, e Cas Bresilla para ajudar com a criação de sapo e preparação embrião. Este trabalho foi financiado pelo NIH através do R01DE021109 concessão para HLS Laura Jacox foi financiado pelo Herschel Smith Graduate Fellowship na Universidade de Harvard e uma subvenção F30 indivíduo comunhão F30DE022989-01 através do NIDCR.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
Riferimenti
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