Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration
Summary
I denne artikkelen introduserer vi fort micro-iontoforese av nevrotransmittere som en teknikk for å undersøke integrering av postsynaptiske signaler med høy romlig og tidsmessig presisjon.
Abstract
En av de grunnleggende interesser i nevrovitenskap er å forstå integreringen av eksitatoriske og hemmende innganger langs svært komplekse strukturen i dendrittiske treet, som til slutt fører til neuronal produksjon av aksjonspotensialer på axon. Påvirkningen av ulike romlige og tidsmessige parametre for spesifikke synaptiske innspill på neuronal produksjonen er for tiden under etterforskning, f.eks avstandsavhengig demping av dendrittiske innganger, plasseringen-avhengige interaksjonen mellom romlig segregerte innganger, påvirkning av GABAergig hemming på eksitatoriske integrasjon, lineær og ikke-lineære integrering moduser, og mange flere.
Med rask mikro-iontoforese av glutamat og GABA er det mulig å presist undersøke den romlige og tidsmessige integrering av glutamatergic eksitasjon og GABAergic hemming. Kritiske tekniske kravene er enten en utløst lysrør, light-emitting diode (LED), eller en to-foton scanning mikroskop for å visualisere dendrittiske grener uten å innføre vesentlig foto-skade av vev. Videre er det meget viktig å ha en mikro-iontoforese forsterker som tillater rask kapasitans kompensasjon av høye motstand pipetter. Et annet viktig punkt er at ingen senderen er uvilkårlig utgitt av pipetten i løpet av eksperimentet.
Når etablert, vil denne teknikk og gir pålitelige og reproduserbare signaler med en høy nevrotransmitter og plassering spesifisitet. Sammenlignet med glutamat og GABA uncaging, gir rask iontoforese med begge sendere på samme tid, men på svært fjerne steder uten begrensning til synsfeltet. Det er også fordeler i forhold til fokal elektrisk stimulering av aksoner: med mikro-iontoforese plasseringen av inngangs området er definitivt kjent, og det er for at kun den nevrotransmitter av interesse er sluppet. Men det må tas i betraktning at med mikro-iontoforese barepostsynapse er aktivert og presynaptiske aspekter av signalstoffet utgivelsen er ikke løst. I denne artikkelen viser vi hvordan du setter opp mikro-iontoforese i hjernen skive eksperimenter.
Introduction
Nevroner i sentralnervesystemet motta en rekke av synaptiske innganger på de tynne og ramified dendrittiske prosesser en. Det er de fleste av de eksitatoriske dendrittiske innganger mediert av glutamatergic synapser. Disse synapser kan aktiveres i en rommessig fordelt måte, noe som resulterer i postsynaptiske lineær integrering av eksitatoriske postsynaptiske potensialer (epsps). Hvis synapsene aktiveres samtidig og i romlig nærhet på Dendritt, kan disse eksitatoriske innganger være integrert supra-lineært og generere dendrittiske toppene 2-5.
Videre avhenger integrering av eksitatoriske innganger på plasseringen av den inngangen på den dendrittiske treet. Signaler som ankommer ved den distale tuft region er mye mer attenuert enn proksimale innganger på grunn av kabel-filtrering 6.. I hippocampus, er fjernt innganger til den apikale dusk dendrites generert av en annen hjernen regionen enn de på proksimale dendrites 7. Et spennende spørsmål er derfor, er hvordan synaptiske innspill behandles av ulike dendrittiske avdelinger og hvis dendrittiske integrering regulerer påvirkning av disse lagdelte innganger på nevronal utløsning på forskjellige måter.
Ikke bare de funksjonelle egenskaper, morfologiske trekk ved Dendritt, er plasseringen og gruppering av inngangene påvirker dendrittiske integrering av eksitatoriske innganger, også den ekstra inhiberende innganger fra gabaergic terminaler avgjørende bestemme effekten av glutamatergic synapser 8,9. Disse forskjellige aspekter ved synaptiske integrasjon kan være ideelt undersøkt ved hjelp av nevrotransmitter mikro-iontoforese, som tillater romlig definerte anvendelse av forskjellige nevrotransmittere til dendrittiske domener. Vi viser her hvordan du lykkes etablere mikro-iontoforese av glutamat og GABA å undersøke signal integrasjon i nerveceller.
For denne søknaden, tynnhøye motstand pipetter fylt med konsentrerte neurotransmitter løsninger brukes. Disse pipetter er plassert nær den ytre membran av cellen, hvor de nevrotransmitter-reseptorer er lokalisert. En god visualisering av de dendrittiske grener er nødvendig. Dette oppnås best ved hjelp av fluorescerende fargestoffer, som er introdusert via plasteret pipette. Da en meget kort (<1 msek) strømpuls (i området fra 10-100 nA) brukes for å løse ut de ladede molekyler nevrotransmitter. Med disse korte pulser og effektiv kapasitans kompensasjon, kan postsynaptiske potensialet eller strøm bli fremkalt med høyere tids-og romlig nøyaktighet, noe som innebærer plasseringen av eksitatoriske inngang er nøyaktig kjent. Glutamat mikro-iontoforese kan aktivere synapser i en definert radius, som er mindre enn 6 um som vist her (fig. 1 9), men det er også mulig å oppnå enkelt synapse oppløsning 10-12.
Heine, M., et al </em> viste at den romlige oppløsning av hurtig mikro-iontoforese kan også bli justert for å få øye på størrelser under 0,5 pm, som er mindre enn punktstørrelse regelmessig oppnås med to-foton uncaging av glutamat 13.. Med rask mikro-iontoforese er det lett mulig å bruke to eller flere iontoforetisk pipetter og plassere dem på ulike, selv fjerne flekker på dendrittiske treet. På denne måten kan integrering av eksitatoriske hendelser, inkludert de fra ulike veier, undersøkes. Det er også mulig å anvende et glutamat og en GABA fylt iontoforetisk pipette samtidig. På denne måten kan virkningen av GABAerg hemming på forskjellige steder i forhold til den eksitatoriske inngangen (på-bane, utenfor-bane inhibering) kan studeres. Også effekten av hemming av interneurons rettet mot spesifikke nevrale domener, som distale dendritter, soma eller aksoner 14, kan bli undersøkt ved hjelp av GABA iontoforese. I dyrkede nerveceller, tilbyr rask mikro-iontoforese muligheten til å investigate enkelt synapse distribusjon og elementære aspektene ved synaptisk kommunikasjon i nevroner i mye mer detalj 10,11.
I denne artikkelen viser vi i detalj hvordan å etablere glutamat og GABA iontoforese for bruk i akutte hjernen skiver, noe som gjør det mulig å undersøke synaptiske integrering av eksitatoriske og hemmende innganger i avhengighet av innspill beliggenhet, innspill styrker, og timing, alene eller i samspill. Vi vil påpeke fordeler og begrensninger av denne teknikken og hvordan å feilsøke vellykket.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her forklarer vi hvordan du søker rask mikro-iontoforese av nevrotransmittere å undersøke synaptiske integrasjon på dendritter. Denne teknikken har blitt brukt til å undersøke glutamatergic og GABAergic synaptisk transmisjon i ulike områder av hjernen in vitro og in vivo 9,20-22. Micro-iontoforese har vært brukt i mer enn 60 år, men i tidlige år ble det mest brukt til enten lokalt gjelder nevrotransmittere og narkotika på langsom eller middels tidsskalaer 23 eller for m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann og Walker Jackson for å lese nøye manuskriptet. Forfatterne fikk støtte som ble gitt av departementet for forskning MIWF av staten Northrhine-Westfalia (SR), BMBF-Projekträger DLR US-tysk samarbeid i beregningsorientert nevrovitenskap (CRCNS; SR), Centers of Excellence i nevrodegenerative sykdommer (COEN; SR), og Universitetet i Bonn egenutført finansiering program (BONFOR; SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
Riferimenti
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscienze. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscienze. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
