Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration
Summary
I den här artikeln presenterar vi snabbt mikro-iontophoresis av signalsubstanser som en teknik för att undersöka integreringen av postsynaptiska signaler med hög rumslig och tidsmässig precision.
Abstract
En av de grundläggande intressena inom neurovetenskap är att förstå integrationen av retande och hämmande insatsvaror längs mycket komplex struktur av dendritiska träd, som så småningom leder till neuronal produktionen av aktionspotentialer på axonet. Inverkan av olika rumsliga och tidsmässiga parametrar specifik synaptisk input på neuronal produktionen är för närvarande under utredning, t.ex. avståndsberoende dämpning av dendritiska ingångar, plats-beroende växelverkan av rumsligt segregerade ingångar, påverkan av GABAergig hämning på excitatoriska integration, linjär och icke-linjära integration lägen, och många fler.
Med snabb mikro-iontophoresis av glutamat och GABA är det möjligt att exakt undersöka rumsliga och tidsmässiga integration av glutamaterg excitation och GABAergic hämning. Kritiska tekniska krav är antingen en utlöst lysrör, lysdioder (LED), eller en två-photon scanning mikroskop för att visualisera dendritiska grenar utan att införa betydande foto-skador på vävnaden. Vidare är det mycket viktigt att ha en mikro-jontofores förstärkare som möjliggör snabb kapacitans ersättning av hög resistans pipetter. En annan viktig punkt är att ingen sändare ofrivilligt frigörs genom pipetten under experimentet.
När etablerade, kommer denna teknik att ge tillförlitliga och reproducerbara signaler med en hög signalsubstans och plats specificitet. Jämfört med glutamat och GABA uncaging, möjliggör snabb iontophoresis använda båda sändarna samtidigt men på mycket avlägsna platser utan begränsning till synfältet. Det finns också fördelar jämfört med fokal elektrisk stimulering av axoner: med mikro-jontofores placeringen av den ingående webbplats är definitivt känd och det är säker på att endast signalsubstansen av intresse släpps. Men det måste beaktas att med mikro-iontophoresis endastpostsynapsen aktiveras och presynaptiska aspekter av neurotransmittorfrisättning är inte löst. I den här artikeln visar vi hur du ställer in micro-jontofores i experiment hjärnan skiva.
Introduction
Nervceller i det centrala nervsystemet får en mängd synaptiska ingångar på sina tunna och förgrenat dendritiska processer 1. Där är majoriteten av de excitatoriska dendritiska ingångar förmedlas av glutamaterg synapser. Dessa synapser kan aktiveras i ett rumsligt fördelad sätt, vilket resulterar i postsynaptiska linjär integration av excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSPs). Om synapser aktiveras samtidigt och rumslig närhet på dendriten, kan dessa excitatoriska ingångar integreras supra-linjärt och generera dendritiska spikar 2-5.
Beror dessutom integrering av excitatoriska ingångar på platsen för ingången på den dendritiska trädet. Signaler som anländer till den bortre tuft regionen är betydligt mer dämpad än proximala ingångar beroende på kabel filtrering 6. I hippocampus, är avlägsna ingångarna till de apikala tuft dendriter genereras av en annan hjärna region än de på proximal dendrites 7. En spännande fråga är därför, hur synaptisk input bearbetas av olika dendritiska fack och om dendritiska integration reglerar inflytandet av dessa skiktade ingångar på neuronaktivitet på olika sätt.
Inte bara de funktionella egenskaperna, morfologiska egenskaper hos dendriten, är på plats och klustring av ingångarna påverkar dendritiska integrering av excitatoriska ingångar, även ytterligare hämmande ingångar från GABAergic terminaler avgörande bestämma effektiviteten av de glutamaterga synapser 8,9. Dessa olika aspekter av synaptisk integration kan idealt undersökas med hjälp av signalsubstansen mikro-iontophoresis, vilket gör rumsligt definierad tillämpning av olika signalsubstanser till dendritiska domäner. Vi visar här hur man framgångsrikt kan etablera mikro-iontophoresis av glutamat och GABA att utreda signal integration i nervceller.
För denna applikation, spetsighög resistans pipetter fyllda med koncentrerade signalsubstans lösningar används. Dessa pipetter är placerade nära den yttre membranet av cellen, där neurotransmittorreceptorer är belägna. En god visualisering av de dendritiska grenarna krävs. Detta uppnås bäst med hjälp av fluorescerande färgämnen, och som införs via plåstret pipetten. Sedan en mycket kort (<1 ms) aktuell puls (i intervallet på 10 – 100 NA) används för att mata de laddade signalsubstansen molekyler. Med dessa korta pulser och effektiv kapacitans ersättning, kan postsynaptiska potentialer och strömmar kan framkallas med hög temporal och rumslig precision, vilket innebär att platsen för den excitatoriska input exakt känd. Glutamat mikro-jontofores kan aktivera synapser i en definierad radie, som är mindre än 6 um som visas här (figur 1 9), men det är också möjligt att nå enda synaps upplösning 10-12.
Heine, M., et al </em> visade att den rumsliga upplösningen i snabb mikro-jontofores även kan justeras för att upptäcka storlekar under 0,5 pm, vilket är mindre än punktstorlekar regelbundet uppnås med två-foton-uncaging av glutamat 13. Med snabb mikro-iontophoresis är det lätt möjligt att använda två eller flera jonoforesiska pipetter och placera dem på olika, även avlägsna fläckar på dendritiska träd. På detta sätt kan integrera excitatoriska händelser, inklusive de från olika banor, undersökas. Det är också möjligt att använda en glutamat och GABA fylld jonoforesisk pipett samtidigt. På detta sätt kan effekten av GABA-avgivande hämning vid olika positioner i förhållande till den excitatoriska ingång (på-bana, off-path hämning) kan studeras. Dessutom, effekterna av hämning av interneuronen inriktade på specifika neuronala domäner som distala dendriter, soma eller axoner 14, kan undersökas med hjälp av GABA jontofores. I odlade nervceller, erbjuder snabb mikro-iontophoresis möjlighet att investigate enda synaps distribution och de elementära aspekterna av synaptisk kommunikation i nervceller i mycket mer detalj 10,11.
I den här artikeln visar vi i detalj hur man kan upprätta glutamat och GABA jontoforesen för användning i akut hjärnan skivor, vilket gör utreder synaptisk integration av retande och hämmande insatsvaror i beroende av input läge, styrkor ingång, och timing, ensam eller i samspel. Vi kommer att påpeka fördelarna och begränsningarna med denna teknik och hur man felsöker framgångsrikt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här förklarar vi hur man ansöker snabb mikro-iontophoresis av signalsubstanser att undersöka synaptisk integration på dendriter. Denna teknik har framgångsrikt använts för att undersöka glutamaterg och GABAergic synaptisk transmission i olika områden i hjärnan in vitro och in vivo 9,20-22. Micro-jontofores har använts i mer än 60 år, men under de första åren var det mest för att antingen lokalt tillämpa signalsubstanser och droger vid långsamma eller mellanliggande tidsram…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann och Walker Jackson för att noggrant läsa manuskriptet. Författarna erhöll finansiering som tillhandahålls av ministeriet för forskning MIWF av staten Nordrhein-Westfalen (SR), den BMBF-Projekträger DLR US-tyskt samarbete i teoretisk neurovetenskap (CRCNS, SR), Centers of Excellence i neurodegenerativa sjukdomar (COEN; SR), och universitetet i Bonn intramural finansieringsprogram (BONFOR, SR).
Materials
| Material | |||
| Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin) | LaVision Biotec, Bielefeld, Germany | ||
| Two-photon laser scanning microscope Ultima IV | Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA | ||
| Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser | Chameleon Ultra II, Coherent | ||
| 60X Objective, NA 0.9 | Olympus | ||
| Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Monochromator | TILLPhotonics, Gräfelfing, Germany | ||
| Micro-iontophoresis system MVCS-02 | NPI Electronics, Tamm, Germany | ||
| Sutter puller P-97 | Sutter Instrument Company, Novato, CA | ||
| Glass filaments (150 GB F 8P) | Science Products, Hofheim, Germany | ||
| Reagent | |||
| Alexa Fluor 488 hydrazide | Molecular Probes life technologies | A-10436 | |
| Alexa Fluor 594 | Molecular Probes life technologies | A-10438 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P9333 | |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S8282 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6297 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C5080 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| K-Gluconate | Sigma Aldrich | G4500 | |
| HEPES-acid | Sigma Aldrich | H4034 | |
| Phosphocreatin | Sigma Aldrich | P7936 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Glutamic acid | Sigma Aldrich | G8415 | |
| GABA | Sigma Aldrich | A5835 | |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | |
| HCl | Merck | 1.09108.1000 |
Riferimenti
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscienze. 102, 527-540 (2001).
- Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
- Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
- Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
- Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
- Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscienze. 31, 571-591 (1989).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
- Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
- Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
- Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
- Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
- Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
- Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
- Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
- Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
- Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
- . . Single-Channel Recording. , (2009).
- Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
- Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
- Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
- Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
- Hahnel, C., Kettenmann, H., Grantyn, R. . Practical Electrophysiological methods. , (1992).
- Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
- Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
- Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2 (2009).
