Afleiden van de Time Cursus van Glutamaat Clearance met een Deconvolutie Analyse van astrocyten Transporter Currents
Summary
We beschrijven een analysemethode om de levensduur van glutamaat schatten op astrocytaire membranen van elektrofysiologische opnames van glutamaat transporter stromingen in astrocyten.
Abstract
De hoogste dichtheid van glutamaat transporters in de hersenen wordt gevonden in astrocyten. Glutmaattransporters paar de beweging van glutamaat door het membraan met de co-transport van 3 Na + en 1 H + en de contra-transport van 1 K +. De stoichiometrische huidige gegenereerd door het transport proces kan worden bewaakt met whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten. Het tijdsverloop van de opgenomen stroom wordt gevormd door het tijdsverloop van de glutamaatconcentratie profiel die astrocyten worden blootgesteld, de kinetiek van glutamaattransporters en de passieve eigenschappen van elektrotone astrocytaire membranen. Hier beschrijven we de experimentele en analytische methoden die kunnen worden gebruikt om glutamaattransporter stromen in astrocyten registreren en isoleren het tijdsverloop van glutamaat toestemming van alle andere factoren die de vorm van de golfvorm van astrocytaire transporter stromen. De hier beschreven methoden kunnen worden gebruikt om een schatting van de levensduur of flash-Uncaged en synaptically-uitgebracht glutamaat bij astrocytaire membranen in elke regio van het centrale zenuwstelsel tijdens gezondheid en ziekte.
Introduction
Astrocyten een van de meest voorkomende soorten cellen in de hersenen met stervormige morfologie en fijne membraan uitsteeksels die zich uitstrekken over de hele neuropil en bereiken naburige synaptische contacten 1,2. Celmembraan van de astrocyten 'is boordevol glutamaat transporter moleculen 3. Onder fysiologische omstandigheden glutmaattransporters snel glutamaat binden aan de extracellulaire zijde van het membraan en overbrengen naar het cel cytoplasma. Door dit te doen, de vervoerders te handhaven lage de basale concentratie van glutamaat in de extracellulaire ruimte 4. Glutamaat transporters in fine astrocytaire processen grenzend aan synapsen prikkelende zijn ideaal gepositioneerd om glutamaat vrijkomt tijdens synaptische gebeurtenissen als het verspreidt weg van de synaptische spleet te binden. Door dit te doen, de vervoerders beperken ook glutamaat spillover naar peri-en extra-synaptische regio's en op naburige synapsen, het verminderen van de ruimtelijke verspreiding van prikkelende signaals in de hersenen 5-7.
Glutamaat transport is een elektrogene proces stoichiometrisch gekoppeld met de beweging van 3 Na + en H + 1 langs hun elektrochemische gradiënt en de contra-transport van 1 K + 8. Glutamaat transport wordt geassocieerd met (maar niet stoichiometrisch gekoppeld aan) een anionisch geleidbaarheid permeabel voor SCN – (thiocyanaat)> NO 3 – (nitraat) ≈ ClO 4 – (perchloraat)> I -> Br -> Cl -> F -, niet tot CH 3 SO 3 – (methaansulfonaat) en C 6 H 11 O 7 – (gluconaat) 9-11. Beide stromingen (stoichiometrische en niet-stoichiometrische) kan worden opgenomen door het verkrijgen van whole-cell patch-clamp opnamen van astrocyten, visueel geïdentificeerd onder Dodt verlichting of voor infrarode differentieel interferentie contrast (IR-DIC) in acute hersenplakjes 12. De stoichiometrische component van de huidige in verband met glutamaat transport over het membraan kan worden geïsoleerd door CH 3 SO 3 -, of C 6 H 11 O 7 – gebaseerde intracellulaire oplossingen en kunnen worden opgeroepen door flash-uncaging glutamaat op astrocyten 13,14, of door het activeren van glutamaat afgifte van naburige synapsen, die elektrisch 12 of met een gerichte optogenetic controle.
Het tijdsverloop van de stoichiometrische component van de huidige transporteur wordt gevormd door de levensduur van de glutamaatconcentratie profiel op astrocyten membranen (bijvoorbeeld glutamaat klaring), de kinetiek van glutmaattransporters, passief membraan eigenschappen van astrocyten en tijdens synaptische stimulaties de synchroniciteit van de afgifte van glutamaat in de geactiveerde synapsen 13. Hier beschrijven we in detail: (1) een experimentele approach de stoichiometrische component van glutamaattransporter stromen van whole-cell patch-clamp van astrocyten in acute muis hippocampale plakken als voorbeeld experimenteel isolaat preparaat, (2) een benadering tot de tijdsduur van glutamaat klaring ontlenen deze opnamen 13, 14. Deze werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het opnemen en analyseren glutamaattransporter stromen van astrocyten in gebieden van het centrale zenuwstelsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een experimentele benadering voor elektrofysiologische opnames te verkrijgen van astrocyten Hier beschrijven wij, een analytisch protocol om glutamaattransporter stromingen isoleren in astrocyten en een wiskundige methode voor het afleiden van het tijdsverloop van glutamaat klaring van astrocytische transporter stromingen.
Het succes van de analyse is gebaseerd op de mogelijkheid om hoge-kwaliteit patch clamp verkrijgen van astrocyten en de nauwkeurigheid van de fitting algoritme gebruikt om…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Stroke Intramurale Research Program (NS002986). AS schreef het manuscript en geïmplementeerd de deconvolutie analyse. JSD ontwikkelde de eerste versie van de deconvolutie analyse en commentaar op de tekst.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
Riferimenti
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
