Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte
Summary
Viene descritto l’uso di un metodo di iniezione dell’ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l’agente patogeno biotrofico Ustilago maydis. Il metodo di inoculazione dell’iniezione dell’ago facilita la somministrazione controllata dell’agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l’agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con U. maydis.
Abstract
Il mais è una delle principali colture cerealicole in tutto il mondo. Tuttavia, la suscettibilità agli agenti patogeni biotrofici è il vincolo primario per aumentare la produttività. U. maydis è un agente patogeno fungino biotrofico e l’agente causale del mais sul mais. Questa malattia è responsabile di perdite di resa significative di circa $ 1,0 miliardi all’anno negli StatiUniti 1 Diversi metodi tra cui la rotazione delle colture, l’applicazione di fungicidi e i trattamenti delle sementi sono attualmente utilizzati per controllare il mal di mais2. Tuttavia, la resistenza dell’ospite è l’unico metodo pratico per gestire il malumore di mais. L’identificazione delle piante coltivate tra cui mais, grano e riso resistenti a vari agenti patogeni biotrofi ha diminuito significativamente le perdite diresa ogni anno 3-5. Pertanto, l’uso di un metodo di inoculazione patogena che fornisca in modo efficiente e riproducibile l’agente patogeno tra le foglie delle piante, faciliterebbe la rapida identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis. Come, un primo passo verso l’identificazione delle linee di mais resistenti a U. maydis, un metodo di inoculazione dell’iniezione di ago e un metodo di screening della reazione di resistenza è stato utilizzato per inoculare le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte con un ceppo di U. maydis e per selezionare piante resistenti.
Le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte, costituite da circa 700 piante, sono state piantate, inoculate con un ceppo di U. maydise vengono schernite per la resistenza. I metodi di inoculazione e screening hanno identificato con successo tre linee di teosinte resistenti a U. maydis. Qui viene presentato un protocollo dettagliato di inoculazione dell’iniezione di ago e screening della reazione di resistenza per le linee di introgressione di mais, teosinte e mais x teosinte. Questo studio dimostra che l’inoculazione dell’iniezione di aghi è uno strumento inestimabile in agricoltura in grado di fornire efficacemente U. maydis tra le foglie delle piante e ha fornito linee vegetali resistenti a U. maydis che ora possono essere combinate e testate nei programmi di allevamento per una migliore resistenza alle malattie.
Introduction
Le malattie fungine delle piante rappresentano una delle minacce più eminenti per l’agricoltura. La necessità di sviluppare colture con una migliore resistenza alle malattie è in aumento a causa del fabbisogno alimentare di una popolazione mondiale in crescita. Gli agenti patogeni vegetali infettano naturalmente le piante coltivate sul campo causando malattie che hanno un impatto negativo sulla resa dellecolture 6. È stato dimostrato che identificare e utilizzare piante resistenti può migliorare la resistenza e ridurre la perdita di resa. Cultivar resistenti sono state identificate in molte specie vegetali tra cui mais, grano, riso e sorgo inoculando le piante con un agente patogeno vegetale e selezionando per linee resistenti7. Pertanto, lo sviluppo e l’uso di un metodo di inoculazione efficiente consentirebbero a molte piante di essere inoculate e vengono vengono utilizzati metodi di inoculazione e schermamento della resistenza. Sono stati utilizzati vari metodi di inoculazione tra cui l’inoculazione del tuffo, la pipettazione della coltura di sospensione delle cellule patogene nel vortice della pianta e l’inoculazione dell’iniezione diago 8-11. Con ogni metodo, l’agente patogeno deve essere introdotto in modo affidabile tra le foglie della pianta in cui l’agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria per garantire lo sviluppo patogenoe l’infezione delle piante 12,13.
Il metodo di inoculazione del tuffo prevede l’immersione di una piantina vegetale in una coltura di sospensione cellulare patogena, mentre il metodo di pipettaggio richiede di posizionare la coltura di sospensione cellulare patogena nel vortice della piantina vegetale. Tuttavia, ci sono problemi con entrambi i metodi. In primo luogo, entrambi i metodi dipendono dal movimento naturale dell’agente patogeno dalla superficie fogliare nel tessuto vegetale che è altamente variabile. La maggior parte degli agenti patogeni entra naturalmente nella pianta attraverso aperture stomatali o ferite sulla superficie fogliare della pianta. Tuttavia, c’è una significativa variabilità nella capacità degli agenti patogeni di penetrare nella superficie fogliare vegetale attraverso gli stomi e / o le ferite sulla superficie fogliare. Pertanto, la penetrazione dell’agente patogeno non può essere controllata con un metodo di inoculazione che potrebbe portare a dati incoerenti. In secondo luogo, quando si vaglia un gran numero di piante, immergere le piantine in una coltura di sospensione cellulare patogena può richiedere molto tempo e può limitare il numero di piante che possono essere schermate. Al contrario, il protocollo di inoculazione dell’iniezione di ago descritto nel presente documento fornisce la coltura di sospensione cellulare patogena tra le foglie della pianta facilitando la formazione di appressoria14. L’agente patogeno utilizza quindi gli appressori di nuova sviluppo per entrare nella pianta eliminando il problema della penetrazione dell’agente patogeno. Inoltre, il protocollo di inoculazione dell’iniezione di ago fornisce una gamma di fenotipi per piante di mais e teosinte che sono state inoculate con U. maydis e dimostrano una buona infezione. I fenotipi possono essere usati come marcatore per determinare la migliore concentrazione per la coltura di sospensione cellulare patogena con conseguente fenotipi vegetali coerenti all’interno e tra diversi esperimenti.
A seguito dell’inoculazione delle piante con una coltura di sospensione cellulare patogena, le piante sono in genere schermate per rilevare un fenotipo resistente osuscettibile 8-11,15. Mentre le scale di valutazione della malattia sono state ampiamente utilizzate per schermare e classificare i fenotipi delle piante, le scale di classificazione differiscono a seconda dell’agente patogeno analizzato. Pertanto, uno stabilimento di protocollo sulla scala di classificazione delle malattie per le interazioni u. maydis e mais può essere utilizzato per agenti patogenifungini simili 16.
La presente serie di protocolli descrive in dettaglio l’inoculazione dell’iniezione di aghi con una coltura di sospensione cellulare U. maydis e lo screening della reazione di reazione di resistenza alle malattie di mais, teosinte e mais x linee di introgressione teosinte. I protocolli attuali non si limitano all’inoculazione dell’iniezione di aghi di U. maydis nelle piante di mais, ma possono essere utilizzati per relativamente qualsiasi agente patogeno fungino e specie vegetale. Pertanto, includere i dettagli di entrambi i metodi nello stesso protocollo consentirà ai ricercatori di utilizzare direttamente i protocolli per l’inoculazione e lo screening o di manipolare i protocolli originali per adattarsi meglio all’agente patogeno e alle specie vegetali di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio il metodo di inoculazione dell’iniezione di ago utilizzato per fornire un ceppo di U. maydis nel gambo di 700 piante di mais e teosinte ha avuto successo. Inoltre, è stata utilizzata una scala di valutazione della resistenza alle malattie rivista per migliorare le piante e rilevare lo sviluppo di agenti patogeni. Come risultato dell’utilizzo di entrambi i metodi, le linee vegetali resistenti agli U. maydis sono state identificate tra 700 piante di mais e teosinte che ora possono essere…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Emir Islamovic per l’assistenza in laboratorio e in serra. Ringraziamo anche il Dr. Sherry Flint-Garcia per aver fornito le linee di introgressione mais x teosinte.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
Riferimenti
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
