En snabb och effektiv metod för att bedöma patogenicitet hos Ustilago maydis på majs- och teosintelinjer
Summary
Användningen av en nål injektion metod för att inokulera majs och teosinte växter med biotrofisk patogen Ustilago maydis beskrivs. Nålinjektionsinokeringsmetoden underlättar den kontrollerade leveransen av svamppatogenen mellan växtbladen där patogenen kommer in i växten genom bildandet av appresoria. Denna metod är mycket effektiv, vilket möjliggör reproducerbara inokuleringar med U. maydis.
Abstract
Majs är en stor spannmålsskörd över hela världen. Mottaglighet för biotrofa patogener är dock det primära tvånget för att öka produktiviteten. U. maydis är en biotrofisk svamp patogen och orsakssambandet av majs smut på majs. Denna sjukdom är ansvarig för betydande avkastningsförluster på cirka 1,0 miljarder dollar årligen i USA1 Flera metoder inklusive växtrotation, fungicidapplikation och fröbehandlingar används för närvarande för att kontrollera majssmut2. Värdresistens är dock den enda praktiska metoden för att hantera majssmut. Identifiering av växtväxter inklusive majs, vete och ris som är resistenta mot olika biotrofa patogener har avsevärt minskat avkastningsförlusternaårligen 3-5. Användningen av en patogen inokuleringsmetod som effektivt och reproducerbart levererar patogenen mellan växtbladen skulle därför underlätta en snabb identifiering av majslinjer som är resistenta mot U. maydis. Som ett första steg mot indentering av majslinjer som är resistenta mot U. maydis, användes en nålinjektionsinokuleringsmetod och en metod för resistensreaktionsscreening för att inokulera majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer med en U. maydis-stam och för att välja resistenta växter.
Majs-, teosint- och majs x teosinteintrogressionslinjer, bestående av cirka 700 växter, planterades, inokulerades med en stam av U. maydisoch screenades för motstånd. Inympnings- och screeningmetoderna identifierade framgångsrikt tre teosintelinjer som är resistenta mot U. maydis. Här presenteras ett detaljerat nål injektion inokulering och resistens reaktion screening protokoll för majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer. Denna studie visar att nål injektion inokulering är ett ovärderligt verktyg inom jordbruket som effektivt kan leverera U. maydis mellan växtbladen och har tillhandahållit växtlinjer som är resistenta mot U. maydis som nu kan kombineras och testas i avelsprogram för förbättrad sjukdomsresistens.
Introduction
Svampsjukdomar hos växter utgör ett av de mest framstående hoten mot jordbruket. Behovet av att utveckla grödor med förbättrad sjukdomsresistens ökar på grund av livsmedelsbehoven hos en växande världsbefolkning. Växtpatogener infekterar naturligt växtväxter i fältet och orsakar sjukdomar som negativt påverkar grödan6. Det har visat sig att identifiering och användning av resistenta växter kan förbättra resistensen och minska avkastningsförlusten. Resistenta sorter har identifierats hos många växtarter, inklusive majs, vete, ris och sorghum genom att inokulera växterna med växtpatogen och välja för resistentalinjer 7. Därför skulle utveckling och användning av en effektiv vaccinationsmetod göra det möjligt för många växter att vaccinelas och screenas för resistens. Olika vaccinationsmetoder har använts inklusive dopp inokulering, pipetting patogen cell suspension kultur i virvel av växten och nål injektion inokulering8-11. Med varje metod skall patogenen på ett tillförlitligt sätt föras in mellan de växtblad där patogenen kommer in i växten genom bildandet av appresoria för att säkerställa patogenutveckling och växtinfektion12,13.
Doppinokuleringsmetoden innebär att man dränker en växtplanta till en patogencellsupphängningskultur, medan pipettingmetoden kräver att patogencellens suspensionskultur placeras i växtplantens virvel. Det finns dock problem med båda metoderna. För det första beror båda metoderna på patogenens naturliga rörelse från bladytan till växtvävnaden som är mycket variabel. De flesta patogener kommer naturligt in i växten genom stomatala öppningar eller sår på växtbladets yta. Det finns dock betydande variationer i patogenernas förmåga att tränga in i växtbladets yta genom stomatan och/eller såren på bladytan. Patogenpenetration kan därför inte kontrolleras med någon av vaccinationsmetoderna, vilket kan leda till inkonsekventa data. För det andra, när man undersöker ett stort antal växter kan nedsänkning av plantorna i en patogencellsupphängningskultur vara tidskrävande och kan begränsa antalet växter som kan screenas. Omvänt levererar nål injektion inokulering protokollet som beskrivs häri patogen cell suspension kultur mellan växtbladen underlättar bildandet av appressoria14. Patogenen använder sedan den nyutvecklade appressoria för att komma in i växten eliminera patogen penetration frågan. Dessutom ger nål injektion inokulering protokollet en rad fenotyper för majs och teosinte växter som har vaccinelats med U. maydis och visar god infektion. Fenotyperna kan användas som en markör för att bestämma den bästa koncentrationen för patogencellens suspensionskultur, vilket resulterar i konsekventa växt fenotyper inom och mellan olika experiment.
Efter växtinympning med en patogen cell suspension kultur, växter är vanligtvis screenade för att upptäcka en resistent eller mottaglig fenotyp8-11,15. Medan sjukdomsklassificeringsskalor har använts i stor utsträckning för att screena och klassificera växt fenotyper, varierar betygsskalor beroende på vilken patogen som analyseras. Därför kan en sjukdomsklassificeringsskala protokolletablering för U. maydis och majsinteraktioner användas för liknande svamppatogener16.
Den nuvarande serien av protokoll beskriver nål injektion inympning med en U. maydis cell suspension kultur och sjukdomsresistens reaktion screening av majs, teosinte och majs x teosinte introgressionslinjer. De nuvarande protokollen är inte begränsade till nålinjektionsinympning av U. maydis i majsväxter men kan användas för relativt alla svamppatogener och växtarter. Därför kommer detaljer i båda metoderna i samma protokoll att göra det möjligt för forskare att direkt använda protokollen för vaccination och screening eller manipulera de ursprungliga protokollen för att bättre passa patogenen och växtarterna av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie var nål injektion inokulering metod som används för att leverera en stam av U. maydis i stammen av 700 majs och teosinte växter framgångsrika. Dessutom användes en reviderad sjukdomsresistensklassificeringsskala för att screena växterna och upptäcka patogenutveckling. Som ett resultat av att använda båda metoderna identifierades växtlinjer som är resistenta mot U. maydis bland 700 majs- och teosinteväxter som nu kan kombineras och testas i avelsprogram för förbättrad sjuk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar dr Emir Islamovic för laboratorie- och växthushjälp. Vi tackar också Dr. Sherry Flint-Garcia för att tillhandahålla majs x teosinte introgressionslinjer.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
Riferimenti
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
