Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem
Summary
Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır. İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.
Abstract
Mısır dünya çapında önemli bir tahıl mahsulüdür. Bununla birlikte, biyotrofik patojenlere duyarlılık, verimliliği artırmanın birincil kısıtlamasıdır. U. maydis biyotrofik bir mantar patojenidir ve mısırdaki mısır smutunun nedensel ajanıdır. Bu hastalık, ABD’de yılda yaklaşık 1,0 milyar dolarlık önemli verim kayıplarından sorumludur1 Şu anda mısır pisliğini kontrol etmek için mahsul rotasyonu, mantar ilacı uygulaması ve tohum tedavileri dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerkullanılmaktadır 2. Bununla birlikte, konak direnci mısır pisliğini yönetmek için tek pratik yöntemdir. Çeşitli biyotrofik patojenlere dirençli mısır, buğday ve pirinç gibi mahsul bitkilerinin tanımlanması yıllık verim kayıplarını önemli ölçüde azaltmıştır3-5. Bu nedenle, patojeni bitki yaprakları arasında verimli ve tekrarlanabilir bir şekilde ulaştıran bir patojen aşılama yönteminin kullanılması, U. maydis’edirençli mısır hatlarının hızlı bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştıracaktır. U. maydis’e dirençli mısır çizgilerinin girintilenmesine yönelik ilk adım olarak, U. maydis suşu ile mısır, teozinte ve mısır x teosinte içe giriş hatlarını aşılamak ve dirençli bitkileri seçmek için bir iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi ve bir direnç reaksiyonu tarama yöntemi kullanılmıştır.
Yaklaşık 700 bitkiden oluşan mısır, teosinte ve mısır x teosinte içe giriş hatları ekildi, U. maydissuşu ile aşılandı ve direnç taraması yapıldı. Aşılama ve tarama yöntemleri, U. maydis’edirençli üç teozinit hattını başarıyla tanımladı. Burada mısır, teozinte ve mısır x teozinte introgression çizgileri için ayrıntılı bir iğne enjeksiyonu aşılama ve direnç reaksiyonu tarama protokolü sunulmuştur. Bu çalışma, iğne enjeksiyonu aşısının tarımda bitki yaprakları arasında U. maydis’i verimli bir şekilde ulaştırabilen paha biçilmez bir araç olduğunu ve artık gelişmiş hastalık direnci için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edilebilen U. maydislere dayanıklı bitki hatları sağladığını göstermektedir.
Introduction
Bitkilerin mantar hastalıkları tarım için en önemli tehditlerden birini temsil eder. Artan dünya nüfusunun gıda ihtiyacı nedeniyle hastalık direnci gelişmiş ürünler geliştirme ihtiyacı artmaktadır. Bitki patojenleri doğal olarak tarladaki mahsul bitkilerini enfekte eder ve mahsul verimini olumsuz etkileyen hastalıklara neden olur6. Dirençli bitkilerin belirlenmesi ve kullanılmasının direnci artırabileceği ve verim kaybını azaltabileceği gösterilmiştir. Mısır, buğday, pirinç ve sorgum dahil olmak üzere birçok bitki türünde bitkilerin bir bitki patojeni ile aşılanması ve dirençli çizgilerin seçilmesi ile dirençli kültivatörler tanımlanmıştır7. Bu nedenle, verimli bir aşılama yönteminin geliştirilmesi ve kullanılması, birçok bitkinin aşılanmasına ve direnç taramasına izin verecektir. Daldırma aşılama, patojen hücre süspansiyon kültürünü bitkinin girdarına pipetleme ve iğne enjeksiyonu aşılama8-11dahil olmak üzere çeşitli aşılama yöntemleri kullanılmıştır. Her yöntemde, patojen gelişimini ve bitki enfeksiyonunu sağlamak için patojenin ekresoria oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında güvenilir bir şekilde patojen tanıtılmalıdır12,13.
Daldırma aşılama yöntemi, bir bitki fidesinin patojen hücre süspansiyon kültürüne batırıltırken, pipetleme yöntemi patojen hücre süspansiyon kültürünün bitki fidesinin girdılmasına yerleştirilmesini gerektirir. Ancak, her iki yöntemle ilgili sorunlar vardır. İlk olarak, her iki yöntem de patojenin yaprak yüzeyinden son derece değişken olan bitki dokusuna doğal hareketine bağlıdır. Patojenlerin çoğu doğal olarak bitki yaprağı yüzeyindeki stomatal açıklıklar veya yaralardan bitkiye girer. Bununla birlikte, patojenlerin bitki yaprağı yüzeyine stomata ve/ veya yaprak yüzeyindeki yaralardan nüfuz etme yeteneğinde önemli bir değişkenlik vardır. Bu nedenle, patojen penetrasyonu, potansiyel olarak tutarsız verilerle sonuçlanan aşılama yöntemi ile kontrol edilemez. İkincisi, çok sayıda bitkiyi tadırken, fideleri patojen hücre süspansiyon kültürüne batırılması zaman alabilir ve taranabilecek bitki sayısını sınırlayabilir. Tersine, burada açıklanan iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, bitki yaprakları arasında appressoria oluşumunu kolaylaştıran patojen hücre süspansiyon kültürünü sağlar14. Patojen daha sonra patojen penetrasyon sorununu ortadan kaldırarak bitkiye girmek için yeni geliştirilen appressoriayı kullanır. Ek olarak, iğne enjeksiyonu aşılama protokolü, U. maydis ile aşılanmış ve iyi enfeksiyon gösteren mısır ve teozinit bitkileri için bir dizi fenotip sağlar. Fenotipler, patojen hücre süspansiyon kültürü için en iyi konsantrasyonu belirlemek için bir işaretleyici olarak kullanılabilir ve bu da farklı deneyler içinde ve arasında tutarlı bitki fenotipleri ile sonuçlanır.
Patojen hücre süspansiyon kültürüne sahip bitki aşılamasını takiben, bitkiler tipik olarak dirençli veya hassas bir fenotip8-11,15tespit etmek için taranır. Hastalık derecelendirme ölçekleri bitki fenotiplerini taramak ve sınıflandırmak için yoğun olarak kullanılırken, derecelendirme ölçekleri analiz edilen patojene bağlı olarak farklılık gösterir. Bu nedenle, benzer mantar patojenleri için U. maydis ve mısır etkileşimleri için bir hastalık derecelendirme ölçeği protokolü kurulması16.
Mevcut protokoller serisi, U. maydis hücre süspansiyon kültürü ile iğne enjeksiyonu aşısını ve mısır, teozinte ve mısır x teosinte introgression çizgilerinin hastalık direnci reaksiyonu taramasını detaylandırır. Mevcut protokoller U. maydis’in mısır bitkilerine iğne enjeksiyonu aşısı ile sınırlı değildir, ancak nispeten herhangi bir mantar patojeni ve bitki türü için kullanılabilir. Bu nedenle, her iki yöntemin ayrıntılarının aynı protokole dahil edilmesini sağlamak, araştırmacıların aşı ve tarama protokollerini doğrudan kullanmalarını veya orijinal protokolleri ilgi çekici patojen ve bitki türlerine daha iyi uyacak şekilde manipüle etmelerini sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada 700 mısır ve teozinte bitkisinin gövdesine U. maydis suşunu ulaştırmak için kullanılan iğne enjeksiyonu aşılama yöntemi başarılı oldu. Ayrıca, bitkileri taramak ve patojen gelişimini tespit etmek için revize edilmiş bir hastalık direnci derecelendirme ölçeği kullanılmıştır. Her iki yöntemin de kullanılması sonucunda, U. maydis’e dirençli bitki hatları, artık hastalık direncinin iyileştirilmesi için ıslah programlarında birleştirilebilen ve test edil…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Emir İslamoviç’e laboratuvar ve sera yardımı için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Sherry Flint-Garcia’ya mısır x teosinte giriş hatlarını sağladığı için teşekkür ederiz.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
Riferimenti
- Smith, J. T. Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses. , (2011).
- Sher, A. F., MacNab, A. A. . Vegetable diseases and their control. , 223-226 (1986).
- Crepet, W. L., Feldman, G. D. The earliest remains of grasses in the fossil record. Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).
- Iltis, H. H., Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. Maize evolution and agricultural origins. Grass systematic and evolution. , 195-213 (1997).
- Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite. Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).
- Agrios, G. N. . Plant Pathology. , (1997).
- Dean, R., et al. The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).
- Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host. Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).
- Freeman, S., Rodriguez, R. J. A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits. Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).
- Gottwald, T. R., Graham, J. H. A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens. Phytopathol. 82, 930-935 (1992).
- Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales). Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).
- Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI). Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).
- Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).
- Christensen, J. J. Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2. , (1963).
- Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen. Sci.. 328, 89-92 (2010).
- Kamper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
- Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut. Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).
- Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize. , (1997).
- Gold, S. E., Kronstad, J. W. Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).
- Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. Ustilago maydis as a Pathogen. Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).
- Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems. J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).
- Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation. Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).
- Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems. Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).
- Banuett, F. Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize. Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).
- Keen, N. T. A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions. Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).
