חקירה תפקודית של מבוגרים ההיפותלמוס Neurogenesis עם הפוקוס ברדיולוגית עיכוב

Summary

הפונקציה של תאי עצב של יונקים בוגרים שנולדו נשארת אזור פעיל של חקירה. קרינה מייננת מעכבת את לידתו של נוירונים חדשים. באמצעות הקרנה המונחה טומוגרפיה מחשב מוקד (CFIR), מיקוד אנטומיים תלת ממדי של אוכלוסיות עצביות ספציפיות כעת ניתן להשתמש כדי להעריך את התפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים.

Abstract

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהווה אתגר משמעותי. יש גישות לעכב neurogenesis למבוגרים באמצעות משלוח נגיפי פולשניים או בעלי חיים מהונדסים בלבול פוטנציאלי שהופכים את הפרשנות של תוצאות מהמחקרים אלה קשים. הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לחקור noninvasively הפונקציה של קבוצות נבחרות של מבוגר יליד נוירונים באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת המוקדים מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת מיקוד של אזורים עצביים ספציפיים. על מנת להאיר את התפקיד הפונקציונלי הפוטנציאלי שנוירוגנזה ההיפותלמוס מבוגר משחקת בוויסות של תהליכים פיסיולוגיים, פיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של מבוגר יליד נוירונים ברוממות החציוני ההיפותלמוס באופן סלקטיבי. אנו מתארים שיטה לomputer C-מודרך טומוגרפיהמשלוח ו ocal ir קרינה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מדויקת מיקוד בבעלי חיים קטנים. CFIR משתמש בהדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של מינון הקרינה, מצמצם את החשיפה לקרינה לאזורים במוח nontargeted, ומאפשר להפצת מינון קונפורמי עם גבולות חדים קרן. פרוטוקול זה מאפשר לאדם לשאול שאלות לגבי תפקידו של מבוגר יליד נוירונים, אבל גם פותח אזורים לשאלות בתחומי radiobiology, ביולוגיה של גידול, ואימונולוגיה. הכלים רדיולוגי אלה יקלו את התרגום של תגליות בספסל לצד המיטה.

Introduction

תגליות שנעשו לאחרונה הראו כי המוח של היונקים הבוגרים יכול לעבור במידה יוצאת דופן של גמישות. מבוגר יליד נוירונים נוצרים לאורך הבגרות בנישות מיוחדות של המוח של היונקים ^1. מהו תפקידיו של מבוגר יליד נוירונים אלה? ויותר מכך, אין הם ממלאים תפקיד בפיזיולוגיה והתנהגות? מחקרים בנושא זה התמקדו באופן מסורתי באזור subventricular של החדרים לרוחב ואזור subgranular של ההיפוקמפוס, עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה מתאפיינים נוירוגנזה באזורים אחרים במוח כגון ההיפותלמוס היונקים ^2. נוירוגנזה כבר דווחה שבלאחר הלידה וההיפותלמוס המבוגר ^2-10, ואת הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס יילוד אלה נותרת אזור פעיל של חקירה.

האפיון הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים עדיין מהוות אתגר משמעותי עבור תחום מדעי המוח באופן כללי. עיכוב סלקטיבי של מפרטific אוכלוסיות עצביות נותרת מוגבלות על ידי חוסר של סמנים מולקולריים זמינים שהנם ייחודיים לאוכלוסיות עצביות אחת ^11. לפיכך, מחיקה סלקטיבית של מבוגר יליד נוירונים מאבות העצביים אלה באמצעות מיקוד גנטי עדיין קשה. כמו כן, משלוח ויראלי למקד מבוגר יליד נוירונים סובל ממשתנים מבלבלים פוטנציאליים כגון החדרת פציעה ודלקת לתוך הסביבה ^12.

הכלים רדיולוגי חדשים צצים, לעומת זאת, המאפשרים אחד כדי לעקוף את הבלבול אלה ולחקור את השאלות האלה באמצעות מיקוד האנטומי מדויק ומדויק בבעלי חיים קטנים. קרינה מייננת מעכבת את הלידה והתמיינות של תאי עצב חדשים, ומאפשרת בשיטה לא פולשנית למקד אוכלוסיות עצביות ^13-15. לאחרונה, תיארתי את האזור נבטי של רוממות היונקים ההיפותלמוס החציוני (ME) שכינינו את אזור שגשוג ההיפותלמוס (HPZ) ² </sup>. מצאנו כי כאשר עכברי נקבה בוגרים צעירים קיבלו תזונה עתירה שומן (HFD), רמות הנוירוגנזה בעכברים שהוזנו-HFD היו גבוהות משמעותי מהאוכל שלהם הנורמלי (NC) בקרות האכילו בי האזור הזה ^2. כדי לבדוק אם neurogenesis למבוגרים בתוך ME ההיפותלמוס מווסת את חילוף החומרים ומשקל, שבקשנו לשבש את התהליך הזה. רוממות החציוני היא מבנה חד צדדי קטן בבסיס של החדר השלישי שממנו ההורמונים רגולטוריים הם שוחררו. על מנת לעכב את התפשטות ונוירוגנזה הבאה מבלי לשנות את הפונקציות פיסיולוגיות האחרות של האזור הזה במוח, שפיתחנו טכניקת הקרנת מוקד פולשנית כדי לעכב את לידתו של נוירונים בוגרים שזה עתה נולדו ברוממות החציוני ההיפותלמוס ² באופן סלקטיבי.

מספר הקבוצות מועסק קרינה לדכא נוירוגנזה באזורים הקנונית ^14-28. עם זאת, גישות רדיולוגי קודמות בדרך כלל ממוקדות שטחים גדולים, או often שלא במתכוון גם ממוקד אזורים במוח שבו מספר רב של נוירוגנזה כבר דיווחו, ולכן קשה לשייך באופן חד משמעי כל פגמים התנהגותיים שנצפו עם מומים באוכלוסיות עצביות ספציפיות. היכולת להקרנה ממוקדת יותר מסופקת על ידי פלטפורמות רדיולוגי המשלבות הדמיה מודרכת טומוגרפיה omputer ג עם הקרינה ו ocal ir קרן מסירה (CFIR) כדי לאפשר האנטומי מדויקת מיקוד ^29-36. קורות קרינה קטנות כמו 0.5 מ"מ קוטר זמינות למקד אוכלוסיות עצביות ספציפיות ^35. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו למקד את ME ההיפותלמוס ולעצור את ההתפשטות ולחסום נוירוגנזה בבעלי חיים קטנים. בעקבות טיפול רדיולוגי על אוכלוסיות אב אלה, ניתן לבצע בדיקות פיסיולוגיות והתנהגותיים כדי להאיר את פונקצית הפוטנציאל של תאי בוגרים שנולדו. מיקוד הפוקוס הוא חשוב במיוחד עבור היישום שלנו מאזבלוטת יותרת המוח ממוקמת קרובה לרוממות החציוני ההיפותלמוס; הקרנה של יותרת המוח עשויה להשפיע על תפקוד הורמונלי ובהמשך לבלבל את התוצאות.

הבסיס הביולוגי לדיכוי ההקרנה הבאה נוירוגנזה עדיין אינו ברור. מחקרי קרינה קודמים הסתמכו על קורות שטח גדולות, והגיעו למסקנה כי דיכוי נוירוגנזה מתווך דרך תגובה דלקתית ^{14, 37.} ככזה הוא לא ברור אם הקרנת מוקד מאוד יכולה לדכא נוירוגנזה, שכן הוא אינו מעורר תגובה דלקתית משמעותית. עם זאת, מחקרים שנעשה לאחרונה על ידי הקבוצה של האזור העצבי הקלאסי בהיפוקמפוס שלנו הוכיחו כי הקרנת מוקד מאוד עם מינון של 10 Gy יכולה לדכא נוירוגנזה לפחות 4 שבועות לאחר הקרנת ^35.

כדי לחקור את הפונקציה של הנוירונים ההיפותלמוס בוגרים שנולדו ברוממות החציוני, אנו משתמשים ד קרינת דיוקevice מסוגל לספק הדמיה CT בשילוב עם קורות קרינה בקוטר קטן כדי לעכב ME נוירוגנזה. שימוש בשפופרת רנטגן מצורף gantry שמסתובבת על פני טווח של 360 °, שאנו מספקים אלומת קרינת מיקרו קשת קורה עם השימוש בשלב דגימת רובוט מבוקר המאפשר סיבוב של נושא בעלי החיים במהלך טיפול בקרינה (איור 1) . גלאי רנטגן ברזולוציה גבוהה המשמשים לרכישת תמונות כאשר gantry הוא במצב האופקי ^33. לצורך המחקר, תמונות CT שוחזרו בגודל voxel איזוטרופיים של 0.20 מ"מ. ההדמיה CT על הלוח אפשרה זיהוי של יעד בעוד החיה נמצאת במצב הטיפול. היעד מקומי באמצעות תוכנת CT הניווט מתכנן במינון, שנכללה עם פלטפורמת רדיולוגי זמינה המסחרית שלנו. לאחר האיתור את ההחזר על ההשקעה שלנו על ידי הדמיה של CT, בעלי החיים הועברו לתפקיד על ידי הטיפול המתאים בשלב הדגימה רובוטית שיש לו ארבע מעלותריס של חופש (X, Y, Z, θ). באמצעות שילוב של זוויות פיגום ושלב רובוט, קורות יכולות להיות מועברות כמעט מכל כיוון ביחס לבעלי החיים, וטיפולים כמו קשת stereotactic אפשריים ^29. לבדיקות הדמיה אחרות אלה וכל, העכברים הוצבו במכשיר קיבוע המאפשר אספקה ​​של גז isoflurane הרדמה תוך הגבלת תנועה. מיטת חוסר התנועה היא CT תואם, ומתחברת לשלב הדגימה רובוטית ^34.

אנו מצפים כי CFIR יספק התקדמות רעיונית במספר תחומי מחקר. למרות שאנו משתמשים במיקוד לפי רדיולוגי של רוממות החציוני ההיפותלמוס כהוכחה לעיקרון של טכניקה זו, CFIR יכול לשמש היעד כל אזור של הגוף של כל אורגניזם מודל קטן באופן עקרוני. בתחום מדעי המוח, למשל, אנו רואים בטכניקה זו יכולה לשמש כדי להעריך את תפקודן של אוכלוסיות אב פעיל שגשוג שהוצע לExis לא באיברי circumventricular אחרים, כגון postrema האזור ^{38, 39,} איבר subfornical ^40, ובלוטת יותרת המוח ^41. מחלוקות ארוכי שנים בנוגע לתפקיד הפונקציונלי של neurogenesis למבוגרים וזיהוי תפקיד סיבתי בהתנהגות יכולות גם עכשיו יהיו טובות יותר לטפל. בציפור שיר, טכניקה זו עשויה להתייחס לתפקיד של neurogenesis המבוגר בשמירה על ההתנהגות החזקה ועונתית של ציוץ ציפור ^42, שכבר הקשו על ידי היכולת לעכב באופן סלקטיבי נוירוגנזה באזורים מסוימים במוח. הבנת מודל התנהגותי חזק זה עשויה לשפוך תובנה חדשה את התפקיד של neurogenesis למבוגרים בויסות התנהגויות מיניים דימורפית אחרות. לחלופין, בתחום מטבולים, CFIR עשוי לשמש כדי לחקור היבטים של התפקיד של התפשטות הפטוציט ותפקידה בחילוף חומרים ומאזן אנרגיה. האפשרות להתקדמות רעיונית בתחומי מחקר רבים היא משופרת על ידי ההקדמה של טכניקה זו.

<p class= "Jove_content"> במאמר זה, אנחנו מדגימים את היכולות של CFIR לאנטומיים דיוק מיקוד של אלומת קרינת מוקד. למרות שאנחנו בהתחלה פיתחנו פלטפורמה זו קרינת חיה קטנה מחקר (SARRP) ללימודים שלנו, מכשירים דומים אחרים זמינים באופן מסחרי, שיכול להשיג הקרנה דומה מודרך CT מוקד ^{43, 44} עכשיו. לפיכך, אנו מכלילים פרוטוקול CFIR זה בצעדים הנדרשים לכל פלטפורמות המחקר ולא את אלה ספציפיים לSARRP. היתרונות של CFIR פני גישות רדיולוגי קודמות לעכב נוירוגנזה הם כי טכניקה זו מאפשרת הדרכת תמונת נפח תלת ממדים ללוקליזציה והמיקוד של המינון, מינון קונפורמי ממזער את החשיפה לאזורים במוח nontargeted, והגיאומטריה קורה דיוק גבוה מאפשרת להפצת מינון קונפורמי עם גבולות קורה חדים. אנחנו מתארים כיצד להשתמש דמיון מודרך-CT למקד את המינון לאזור אנטומי ספציפי, ועל כך, איך לדמיין את הקרינהמינון הפצה ישירות ברקמות באמצעות מכתים immunohistochemical לγ-H2AX, סמן של הפסקות גדילי הדנ"א כפולות ^{35, 45-48.} השימוש בגישה זו להקרנה סלקטיבית של נישות עצביות עשויה להיות השלכות משמעותיות בחושף את התפקיד הפונקציונלי של מבוגר יליד נוירונים חדש על פיזיולוגיה ומחלות.

Protocol

שימוש בבעלי חיים לקבל אישור מועדת טיפול בבעלי חיים והשימוש מוסדי לפרוטוקולי טיפול ושימוש סטנדרטיים. הפרוטוקול הנוכחי פותח ללימודי הקרנת מוקד בעכברים בוגרים ישנים 5.5-10 שבוע C57BL6 / J, כפי שתואר לעיל (איור 2) 2. עם זאת, בגיל…

Representative Results

מיקוד ודיוק מודרכים-CT הערכה הכיול המכני של המערכת הוא חיוני להבטחה שקורות מזוויות שונות בכל מצטלבות בנקודה אחת. כיול בוצע עם שיטת הדמיה מבוססת אוטומטית למחצה, שבו דיוק יישור קצה לקצה כבר נמדד להיות 0.2 מ"מ 29. דיוק זה הוא קריט?…

Discussion

הקרנה מודרכת-CT מוקד (CFIR) היא רומן גישת מערכת שלמה מסוגל לספק שדות קרינה למטרות בבעלי חיים קטנים שבשליטה רובוטית באמצעות CT-הדרכה ^32. היכולת של CFIR לספק אלומה ממוקדת מאוד למודלים של בעלי חיים קטנים מספקת הזדמנויות מחקר חדשות לגשר מחקר במעבדה ותרגום קליני. מאמר זה מת?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
SARRP research platform	Xstrahl	RS225A	http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP irradiation bunker	Xstrahl		Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding
GAF chromic film	IPS	GAFchromic ETB2
Mouse phantom	Gammex	457	Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.
Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody	Millipore, Inc.	05-636	clone JBW301
High-fat rodent diet	Research Diets	D12492i	60% of the calories as fat, food should be irradiated
Isoflurane	Baxter Healthcare Corporation	10019-360-40
0.01 M Sodium citrate	Fisher Scientific		1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water
Superfrost Plus slides	Fisher Scientific	12-550-15
DAPI	Fisher Scientific		nuclear counterstain
Mounting medium	Fisher Scientific		Vectashield or Gelvatol is preferred