Oppdager, visualisere og kvantifisere generasjon av reaktive oksygen arter i en Amoeba Model System

Summary

Vi tilpasset et sett av protokoller for måling av reaktive oksygenforbindelser (ROS) som kan brukes i ulike Amoeba og pattedyr cellulære modeller for kvalitative og kvantitative studier.

Abstract

Reaktive oksygen arter (ROS) består av en rekke reaktive og kortlivede, oksygenholdige molekyler, som er dynamisk interconverted eller elimineres enten katalytisk eller spontant. På grunn av den korte liv spenner fra de fleste ROS og mangfoldet av sine kilder og subcellulære lokaliseringer, kan et fullstendig bilde oppnås bare ved forsiktig målinger ved hjelp av en kombinasjon av protokoller. Her presenterer vi et sett med tre forskjellige protokoller ved hjelp OxyBurst Grønn (OBG)-belagt perler, eller dihydroethidium (DHE) og Amplex UltraRed (AUR), for å overvåke kvalitativt og kvantitativt ulike ROS i profesjonelle fagocytter som Dictyostelium. Vi optimalisert perler belegningsprosedyrer og brukte OBG-belagte perler og live mikros å dynamisk visual intraphagosomal ROS generasjon på celle-nivå. Vi identifiserte lipopolysakkarid (LPS) fra E. coli som en potent stimulator for ROS generasjon i Dictyostelium. I tillegg vi developed sanntid, medium-throughput analyser ved hjelp DHE og AUR å kvantitativt måle intracellulær superoksid og ekstracellulære H ₂ O _{2-produksjon,} hhv.

Introduction

Reaktive oksygenarter (ROS) er involvert i en rekke biologiske prosesser som vertsforsvar, signalering, vev utvikling og respons på skade, så vel som hypertensjon og kreft. Den godt studert phagosomal NADPH oksidase maskiner er dedikert til rask ROS generasjon, kjent som den oksidative burst, for å drepe bakterier inntatt i nøytrofile 'phagosomes ^en. I tillegg ble lekkasje av elektroner som et biprodukt av den mitokondrielle respiratoriske kjeden tidligere antatt å være ansvarlig for bare en uregulert kilde ROS. Men i det siste, og ble identifisert som en viktig mekanisme for å bidra til intraphagosomal dreping av bakterier i musemakrofager ^2. I de senere årene har det sosiale amøbe, Dictyostelium, bli en mektig og populær modell for å studere celle iboende mekanismer i det medfødte immunrespons. Faktisk Dictyostelium og humane fagocytter har en overraskende høy grad av konservering i molekylr machineries ansvarlige for bakterier sensing, engulfment og drepe ^3,4. De homologer av proteiner og enzymer som er relatert til ROS eller avgiftning, slik som NADPH oksidase, catalases, superoxide Dismutases, kan finnes i human-og Dictyostelium. Som best studerte amøbe, presenterer Dictyostelium flere unike fordeler fremfor pattedyrmodellsystem. De vokser ved romtemperatur uten behov for _CO2, med en dobling tid på 8-10 timer. De kan lett bli holdt som tilhenger eller suspensjonskulturer. I tillegg, takket være deres fullt sekvensert og annotert haploid genom, og til enkel genetisk manipulasjon, har Dictyostelium blitt en svært attraktiv eksperimentell modell organisme.

I tidligere studier, diverse klorerte og fluorerte derivater av fluorescein (kollektivt kjent som OxyBurst Green, OBG) som avgir fluorescens etter oksidasjon av ROS, har blitt brukt som en ROS reporter. Cell-permeant esterified derivater benyttes til å måle cytoplasmatisk ROS, mens celle-impermeant dekstran-eller protein-koblede derivater benyttes til å måle ekstracellulære ROS. Spesielt har OBG BSA-belagte perlene som allerede er blitt brukt for å detektere phagosomal ROS-produksjon i pattedyrceller ^5. Imidlertid kan det mikroplateleser baserte tilnærmingen bare gi et gjennomsnitt ROS generasjon kurve fra en populasjon av celler. Med dagens protokoll, ved hjelp av Dictyostelium, en profesjonell phagocyte, og optimaliserte eksperimentelle forhold, får vi stabil og effektiv fagocytose uten conjugating noen opsonin på perlene. DHE har vært brukt i forskjellige modellsystemer, slik som pattedyr nøytrofiler og makrofager, for å detektere ROS produksjons ^6-9. I mellomtiden er det noen controversies over spesifisitet og sensitivitet for metoden ^8,10. Som en forbedret versjon av Amplex Red, fluorescensintensiteten av AUR er mindre følsom overfor pH, noe som gjør det mer egnet til å måleROS i nonneutral eller svakt sure miljøer. AUR har nylig blitt brukt i flere pattedyr systemer ^11,12, men bruken i nonmammalian modeller, som ganske ofte krever svakt syrlig vekstmedier, har ikke blitt rapportert ennå. I tillegg er det ingen publiserte protokoll til kvantitativt og dynamisk måle ROS produksjon og lokalisering i det sosiale amøbe Dictyostelium.

Målet med den presenterte sett av protokoller er å gi en enkel og allsidig løsning for å overvåke ulike ROS og deres lokalisering, og videre gi innsikt i ROS-relaterte cellulære mekanismene. For OBG analysen, brukte vi leve mikros å overvåke hele prosessen med phagosomal ROS generasjon etter opptak av OBG-belagte perler av Dictyostelium celler, og gitt en ny tilnærming for å studere mekanismen av intraphagosomal drap av bakterier. Vi har optimalisert medium gjennomstrømming DHE og AUR-analyser i Dictyostelium, for å måle intracellulær superoxide og ekstracellulære H ₂ O _{2-produksjon,} henholdsvis, ved hjelp av LPS som en potent stimulator ROS. Legg merke til at LPS ble nylig vist å øke den baktericide aktivitet av Dictyostelium mot phagocytosed bakterier ^13. I tillegg behandling med DEDTC og katalase eksplisitt bekreftet at disse to metodene spesifikt måle ulike typer og subcellulære lokaliseringer av ROS i Dictyostelium. Endelig kan OBG assay tilpasses enhver vedheftende fagocytisk celle, ved ytterligere opsonizing perlene med ligander for fagocytiske reseptorer av dyreceller. I prinsippet kan de DHE og AUR-analyser også være finjustert for målinger i alle tilhenger eller ikke-festede celle under passende eksperimentelle forhold.

Protocol

En. Visualisering og Kvalitativ måling av ROS Produksjonen i phagosomes De OBG-belagte perler bør være forberedt på forhånd. Perlene belegningsprosedyrer og agar overlay teknikk er tilpasset fra publiserte referanser 5,14. Tilsett 1 ml suspensjon av 3,0 mikrometer karboksylerte silika perler (ca. 1,8 x 10 9 perler) til et 1,5 ml rør, vaske perlene 3x med 1 ml PBS ved hurtigsentrifugering og virvling. Resuspender perlene i 1 ml PBS inneholdende…

Representative Results

Den generasjonen av ROS i phagosomes kan visualiseres kvalitativt og dynamisk ved mikroskopi (File S1). Den røde fluorescensen avgitt av Alexa fluor 594 er pH-ufølsomme og forblir konstant i phagosomal miljø, mens oksydasjon av OBG øker dens fluorescens i den grønne kanalen. Utslipps spektra av in vitro oksidert og nonoxidized OBG-belagte perler er sammenlignet i figur 1B, som viser en betydelig økning i intensitet etter oksidasjon. For å legge til rette for visualiserin…

Discussion

Sammenlignet med de tidligere beskrevne metoder, OBG assay dynamisk visualiserer prosessen med phagosomal ROS generering på enkeltcelle-nivå, istedenfor å måle en gjennomsnittlig ROS-signal fra en populasjon av celler. Slike befolkningsGjennomsnitt metoder tendens til å skjule viktig informasjon forårsaket av nonsynchronous fagocytose. Vi vellykket tilpasset DHE og AUR-analyser til Dictyostelium og optimalisert protokollene. Viktigst, vi angitt hvilke typer og subcellulære lokaliseringer av ROS målt ved…

Materials

			REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
			EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx