Detectando, visualizar e quantificar a geração de espécies reativas de oxigênio em um modelo de sistema Amoeba

Summary

Nós adaptamos um conjunto de protocolos para a medição de espécies reativas de oxigênio (ROS) que podem ser aplicados em vários modelos celulares ameba e mamíferos para estudos qualitativos e quantitativos.

Abstract

Espécies reativas de oxigênio (ROS) compreendem uma gama de moléculas reativas e de curta duração contendo oxigênio, que são dinamicamente interconvertidos ou eliminados ou cataliticamente ou espontaneamente. Devido aos curtos períodos de vida da maioria ROS ea diversidade de suas fontes e localizações subcelulares, um quadro completo só pode ser obtida por meio de medições cuidadosas usando uma combinação de protocolos. Aqui, apresentamos um conjunto de três protocolos diferentes usando OxyBurst Green (OBG) revestida de contas, ou dihydroethidium (DHE) e Amplex Ultrared (AUR), para monitorar qualitativa e quantitativamente vários ROS em fagócitos profissionais, como Dictyostelium. Nós otimizamos os processos de revestimento contas e miçangas OBG revestidos usados ​​e microscopia ao vivo para visualizar dinamicamente intraphagosomal geração ROS no nível de uma única célula. Foram identificados lipopolissacarídeo (LPS) de E. coli como um potente estimulador para a geração de ROS em Dictyostelium. Além disso, nós dtempo real eveloped, ensaios de médio rendimento, utilizando DHE e AUR para medir quantitativamente superóxido intracelular e extracelular H ₂ O ₂ a produção, respectivamente.

Introduction

Espécies reativas de oxigênio (ROS) estão envolvidos em uma ampla variedade de processos biológicos, tais como a defesa do hospedeiro, a sinalização, o desenvolvimento do tecido e resposta à lesão, bem como hipertensão e câncer. O phagosomal NADPH oxidase máquinas bem estudado é dedicado a geração de ROS rápida, conhecida como a explosão oxidativa, para matar as bactérias ingeridas em phagosomes dos neutrófilos ^1. Além disso, o vazamento de elétrons como um subproduto da cadeia respiratória mitocondrial foi previamente pensado para ser responsável apenas por uma fonte não regulamentada de ROS. Mas, recentemente, foi identificado como um mecanismo importante para contribuir para a matança intraphagosomal de bactérias nos macrófagos do rato ^2. Nos últimos anos, a ameba social Dictyostelium, tornou-se um modelo poderoso e popular para o estudo de células mecanismos intrínsecos da resposta imune inata. De fato, Dictyostelium e fagócitos humanos partilham uma surpreendentemente alto nível de conservação em molecular máquinas responsáveis ​​por bactérias sentindo, imersão e matando ^3,4. Os homólogos de proteínas e enzimas relacionadas com a produção de ROS e toxinas, tais como oxidase de NADPH, catalases, superóxido dismutase, pode ser encontrado em humanos e Dictyostelium. À medida que a ameba melhor estudada, Dictyostelium apresenta várias vantagens únicas sobre sistema modelo de mamíferos. Eles crescer à temperatura ambiente, sem a necessidade de CO _2, com um tempo de duplicação de 8-10 horas. Eles podem ser facilmente mantidas como culturas aderentes ou em suspensão. Além disso, graças ao seu genoma haplóide completamente seqüenciado e anotado, e para a manipulação genética fácil, Dictyostelium tornou-se um modelo muito atraente organismo experimental.

Em estudos anteriores, vários derivados clorados e fluorados de fluoresceína (conhecidos coletivamente como OxyBurst verde, OBG) que emitem fluorescência após a oxidação por ROS, têm sido usados ​​como um repórter ROS. Cell-permeante esterified derivados são usados ​​para medir citoplasmática ROS, enquanto dextrano ou derivados acoplados à proteína de células-impermeabilizante são usados ​​para medir ROS extracelular. Em particular, grânulos de OBG-ASB revestidas já tiverem sido usadas para detectar a produção de ROS phagosomal em células de mamíferos ^5. No entanto, a abordagem baseada em leitor de microplacas só pode dar uma curva de geração de ROS em média de uma população de células. Com o presente protocolo, usando Dictyostelium, um dos fagócitos profissionais e condições experimentais otimizadas, obtemos fagocitose estável e eficiente, sem conjugar qualquer opsonina sobre as contas. DHE tem sido usada em vários sistemas de modelos, tais como os neutrófilos e macrófagos de mamífero, para detectar a produção de ROS ^6-9. Enquanto isso, existem algumas controvérsias sobre a especificidade e sensibilidade do método ^8,10. Como uma versão melhorada de Amplex Red, a intensidade de fluorescência de AUR é menos sensível ao pH, o que torna mais adequado para medirROS em ambientes não-neutras ou fracamente ácidas. AUR foi recentemente aplicado em vários sistemas de mamíferos ^11,12, mas a sua utilização em modelos não mamíferos, o que muitas vezes necessitam de meios de crescimento ligeiramente ácido, não tem sido relatado ainda. Além disso, não existe um protocolo publicado quantitativamente e dinamicamente medir a produção e localização ROS na ameba Dictyostelium sociais.

O objetivo do conjunto de protocolos apresentados é fornecer uma solução fácil e versátil para monitorar vários ROS e sua localização, e ainda dar insights sobre os mecanismos celulares relacionados com o ROS. Para o ensaio de OBG, usamos a microscopia ao vivo para acompanhar todo o processo de geração de ROS phagosomal após a captação de contas OBG revestidos por células Dictyostelium, e forneceu uma nova abordagem para estudar o mecanismo de matar intraphagosomal de bactérias. Nós otimizamos de médio rendimento DHE e AUR ensaios em Dictyostelium, para medir Superox intracelularide e H ₂ O ₂ extracelular produção, respectivamente, utilizando LPS como um potente estimulador de ROS. Observe que o LPS foi recentemente demonstrado que o aumento da actividade bactericida de Dictyostelium direcção bactérias ingeridas ^13. Além disso, o tratamento com DEDTC e catalase confirmado explicitamente que estes dois métodos de medir especificamente diferentes tipos e localizações subcelulares de ROS em Dictyostelium. Finalmente, o ensaio de OBG pode ser adaptado a qualquer célula fagocítica aderente, por opsonizantes ainda mais os grânulos com ligandos para receptores de células fagocíticas animais. Em princípio, os ensaios de DHE e AUR pode ser também para medições em qualquer célula aderente ou não aderente em condições experimentais apropriadas aperfeiçoá-lo.

Protocol

1. Visualização e medição qualitativa de ROS Produção em Fagossomos As contas OBG revestidos deve ser preparado com antecedência. Os processos de revestimento miçangas e técnica agar são adaptados a partir de referências publicadas 5,14. Adicionar 1 ml de suspensão de 3,0 mM esferas de sílica carboxiladas (cerca de 1,8 x 10 9 esferas) em um tubo de 1,5 ml, lavar as contas 3x com 1 ml de PBS por centrifugação rápida e centrifugação. …

Representative Results

A geração de ROS em phagosomes pode ser visualizada qualitativamente e dinamicamente por microscopia (S1 do ficheiro). A fluorescência vermelha emitida pela Alexa fluor 594 é insensível pH e mantém-se constante no ambiente phagosomal, enquanto que a oxidação de OBG aumenta a fluorescência no canal verde. O espectro de emissão de ensaios in vitro e oxidado OBG grânulos revestidos não oxidados são comparados na Figura 1B, que mostra um aumento significativo …

Discussion

Em comparação com os métodos anteriormente descritos, o ensaio de OBG visualiza dinamicamente o processo de geração de ROS phagosomal ao nível da célula individual, em vez de medir o sinal médio ROS a partir de uma população de células. Tais métodos população de amostragem tendem a obscurecer a informação crítica causada por fagocitose não-sincrónico. Nós adaptado com sucesso DHE e AUR ensaios para Dictyostelium e otimizados os protocolos. Mais importante, nós especificados os tipos e local…

Materials

			REAGENTS
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
Carboxylated silica beads	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C medium	ForMedium	HLC0102
LoFlo medium	ForMedium	LF1001
Bacto agar	BD	204010
Dihydroethidium	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
Horseradish peroxidase	Roche	10108090001
Diethyldithiocarbamate (DEDTC)	Sigma	D3506-100G
Catalase	Sigma	C9322-1G
Cyanamide	Sigma	187364-25G
Lipopolysaccharides	Sigma	L2630-25G
			EQUIPMENT
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	Bottom made of optically clear plastic
MatTek dish 35 mm	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	Bottom made of a glass coverslip
Scepter Cell Counter	Merck Millipore	PHCC00000
White 96 well plate	Nunc	236108
Centrifuge	SORVALL	Legend RT
Microplate reader	BioTek	Synergy Mx