Multiplex Fluorescent Microarray för Human Saliv Protein Analysis Använda Polymer Mikro och Fiberoptiska Bundles
Summary
Vi beskriver ett förfarande för profilering salivproteiner använda multiplexade mikrosfärbaserade arrayer antikroppar. Monoklonala antikroppar kovalent kopplade till fluorescerande färgämne-kodat 4,5 ìm polymermikrosfärer med hjälp karbodiimid kemi. De modifierade mikrosfärer avsattes i fiberoptiska mikrobrunnar för att mäta proteinnivåer i saliv med hjälp av fluorescens sandwichimmunoanalyser.
Abstract
Häri beskriver vi ett protokoll för att samtidigt mäta sex proteiner i saliv genom att använda en fiberoptisk mikrosfärbaserade antikropp array. Den immuno-array-teknologin utnyttjas kombinerar fördelarna med mikrosfärbaserat suspensions array tillverkning med användning av fluorescensmikroskopi. Som beskrivs i videon protokollet, var kommersiellt tillgängliga 4,5 ìm polymermikrosfärer kodas in i sju olika typer, uppdelade efter koncentrationen av två fluorescerande färger fysiskt fångade inuti mikrosfärerna. De kodade mikrosfärer innehållande ytan karboxylgrupper modifierades med monoklonala infångnings antikroppar via EDC / NHS kopplingskemi. För att sätta samman proteinmikroarray, de olika typer av kodade och funktionaliserade mikrosfärer blandades och slumpvis avsattes i 4,5 | im mikrobrunnar, som är kemiskt etsade vid den proximala änden av en fiberoptisk bunt. Det fiberoptiska knippet användes som både en bärare och för avbildning av microspheres. När monterad, var microarray som används för att fånga in proteiner i saliven supernatant uppsamlades från kliniken. Upptäckten bygger på en sandwich immunoassay med en blandning av biotinylerade antikroppar upptäckt för olika analyter med streptavidinkonjugerat fluorescerande sond, R-fykoerytrin. The microarray avbildades genom fluorescensmikroskopi i tre olika kanaler, två för mikrosfär registrering och en för analysen signalen. Fluorescensmikrofotografier sedan avkodas och analyseras med hjälp av en hemmagjord algoritm i MATLAB.
Introduction
Sedan den första microarray rapporterades av Mark Schena och medarbetare i mitten av 1990-talet, har detta kraftfulla verktyg använts inom många områden av biologisk forskning 1. Antikropps microarrays kan samtidigt upptäcka flera proteiner i diagnostiska vätskor, såsom blod, har viktiga tillämpningar inom klinisk diagnostik och biomarkör screening 2-10. Saliv, som innehåller många av de analyter som blod, har betraktats som ett bättre alternativ till blod eftersom saliv samling är säker, icke-invasiv, och kan utföras med minimalt utbildad medicinsk personal 11-13. För närvarande är multiplexerad proteinanalys med användning av salivprover begränsas av flera viktiga faktorer, inklusive den låga koncentrationen av målanalyt 14 och det breda koncentrationsintervall av olika biomarkörer 15.
.Häri visar vi en analys av sex proteiner: human vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukin-8 (IL-8), epidermal tillväxtfaktor (EGF), matris metallopeptidas 9 (MMP-9), och interleukin-1 beta (IL-1β) . Utförandet av metoden initialt kontrolleras med hjälp av standardlösningar utgör rekombinanta analyt proteiner och blockeringsbuffert. Real salivprover från patienter med olika kroniska luftvägssjukdomar samt friska kontroller testades också med tillfredsställande resultat. Protokollet bör tillämpas på andra protein analyter och andra mikrosfärbaserade analyser. Denna plattform erbjuder avsevärda fördelar för analytisk kemi fält som det möjliggör snabb, noggrann och reproducerbar samtidig analys av låga koncentrationer av flera proteiner med ett brett dynamiskt omfång, minimala icke-specifika interaktioner, minskad provförbrukning, och låg kostnad i jämförelse med en analog enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskare bör ägna extra uppmärksamhet åt följande åtgärder: bättre avkodning noggrannhet är det nödvändigt att kontrollera de mikrosfärerna suspenderades homogent i alla inkubation och tvätta steg under mikrosfärer kodningsförfarandet. Dessutom, de kodade mikrosfärerna måste skyddas från ljus under hela experimentet. Efter korrekt kodning och lagringsförfaranden, fann vi att den totala avkodning noggrannhet var över 99%. De kodade mikrosfärer bör förvaras vid 4 ° C. Undvik frysning och sk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrags 08UDE017788-05). EBP erkänner också stöd från den spanska stiftelsen för vetenskap och teknik (FECYT). Författarna tackar Shonda T. Gaylord och Pratyusha Mogalisetti för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Riferimenti
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
