बहुलक microspheres और फाइबर ऑप्टिक बंडलों का उपयोग मानव लार प्रोटीन विश्लेषण के लिए मल्टिप्लेक्स फ्लोरोसेंट माइक्रोएरे
Summary
हम मल्टिप्लेक्स microsphere आधारित एंटीबॉडी का उपयोग कर लार प्रोटीन की रूपरेखा के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी covalently carbodiimide रसायन विज्ञान का उपयोग फ्लोरोसेंट डाई इनकोडिंग 4.5 माइक्रोन बहुलक microspheres से जुड़े थे. संशोधित microspheres प्रतिदीप्ति सैंडविच immunoassays उपयोग कर लार में प्रोटीन का स्तर मापने के लिए फाइबर ऑप्टिक microwells में जमा थे.
Abstract
इस के साथ साथ, हम एक साथ एक फाइबर ऑप्टिक microsphere आधारित एंटीबॉडी सरणी का उपयोग कर लार में छह प्रोटीन को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन. नियोजित इम्युनो सरणी प्रौद्योगिकी प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग के साथ microsphere आधारित निलंबन सरणी निर्माण के लाभों को जोड़ती है. वीडियो प्रोटोकॉल में वर्णित है, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4.5 माइक्रोन बहुलक microspheres शारीरिक रूप से microspheres के अंदर फंसे दो फ्लोरोसेंट रंगों की एकाग्रता से भेदभाव सात विभिन्न प्रकार, में इनकोडिंग गया. सतह carboxyl समूहों युक्त इनकोडिंग microspheres EDC / एनएचएस युग्मन रसायन शास्त्र के माध्यम से मोनोक्लोनल कब्जा एंटीबॉडी के साथ संशोधित किया गया है. प्रोटीन माइक्रोएरे इकट्ठा करने के लिए, और इनकोडिंग functionalized microspheres के विभिन्न प्रकार के मिश्रित थे और बेतरतीब ढंग से रासायनिक एक फाइबर ऑप्टिक बंडल के प्रॉक्सिमल अंत में etched गया है जो 4.5 माइक्रोन microwells में जमा है. फाइबर ऑप्टिक बंडल एक वाहक के रूप में दोनों और एम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया थाicrospheres. एक बार इकट्ठे, माइक्रोएरे क्लिनिक से एकत्र लार सतह पर तैरनेवाला में प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पता लगाने के एक streptavidin संयुग्मित फ्लोरोसेंट जांच, आर phycoerythrin साथ अलग analytes के लिए biotinylated पता लगाने के एंटीबॉडी का एक मिश्रण का उपयोग कर एक सैंडविच immunoassay पर आधारित था. माइक्रोएरे microsphere पंजीकरण और परख संकेत के लिए एक के लिए तीन अलग अलग चैनलों, दो में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी ने उतारी थी. प्रतिदीप्ति micrographs तो डीकोड और matlab में एक घर का बना कलन विधि का उपयोग विश्लेषण किया गया.
Introduction
मार्क Schena और 1990 के मध्य में सहकर्मियों द्वारा रिपोर्ट पहले माइक्रोएरे के बाद से, इस शक्तिशाली उपकरण जैविक अनुसंधान 1 के कई क्षेत्रों में उपयोग किया गया है. एक साथ इस तरह के खून के रूप में नैदानिक तरल पदार्थ, में कई प्रोटीन का पता लगाने में सक्षम एंटीबॉडी, नैदानिक निदान और biomarker स्क्रीनिंग 2-10 में महत्वपूर्ण आवेदन किया है. लार, रक्त के रूप में ही analytes की कई युक्त लार संग्रह, सुरक्षित noninvasive है क्योंकि रक्त के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में माना गया है, और न्यूनतम प्रशिक्षित चिकित्सा कर्मियों 11-13 से बाहर किया जा सकता है. वर्तमान में, लार के नमूनों का प्रयोग मल्टिप्लेक्स प्रोटीन विश्लेषण लक्ष्य analyte 14 की कम एकाग्रता और अलग बायोमार्कर 15 की व्यापक एकाग्रता रेंज सहित कई महत्वपूर्ण कारकों द्वारा सीमित है.
.इस के साथ साथ, हम छह प्रोटीन का विश्लेषण का प्रदर्शन: मानव संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF), इंटरफेरॉन गामा प्रेरित प्रोटीन 10 (आईपी 10), इंटरल्यूकिन -8 (आईएल -8), epidermal वृद्धि कारक (EGF), मैट्रिक्स metallopeptidase 9 (एमएमपी 9), और इंटरल्यूकिन -1 बीटा (आईएल 1β) . विधि का प्रदर्शन शुरू में पुनः संयोजक analyte प्रोटीन का गठन और अवरुद्ध बफर मानक समाधान का उपयोग कर सत्यापित किया गया था. विभिन्न जीर्ण सांस की बीमारियों के मरीजों के साथ ही स्वस्थ नियंत्रण से एकत्र रियल लार के नमूने भी संतोषजनक प्रदर्शन के साथ परीक्षण किया गया. प्रोटोकॉल अन्य प्रोटीन analytes और अन्य microsphere आधारित assays के लिए लागू किया जाना चाहिए. यह एक की तुलना में एक व्यापक गतिशील रेंज, कम से कम गैर विशिष्ट बातचीत, कम नमूना खपत, और कम लागत के साथ कई प्रोटीन की कम मात्रा का तेजी से, सही, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य एक साथ विश्लेषण सक्षम बनाता है के रूप में इस मंच विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के क्षेत्र को काफी लाभ प्रदान करता है अनुरूप एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा).
Protocol
Representative Results
Discussion
शोधकर्ताओं निम्नलिखित कदम को अतिरिक्त ध्यान देना चाहिए: बेहतर डिकोडिंग सटीकता के लिए, यह microspheres एक ही ढंग से सभी ऊष्मायन में निलंबित कर दिया गया सत्यापित और microspheres एन्कोडिंग प्रक्रिया के दौरान कदम धोने क?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (अनुदान 08UDE017788-05) द्वारा समर्थित किया गया. ईबीपी भी विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए स्पेनिश फाउंडेशन (FECYT) से समर्थन मानता है. लेखकों पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Shonda टी. जेराल्ड और Pratyusha Mogalisetti धन्यवाद.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Riferimenti
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