Multiplexed Fluorescent Mikromatrise for Menneskelig Spytt Protein Analysis Bruke Polymer microspheres og Fiberoptisk Bundles
Summary
Vi beskriver en fremgangsmåte for profilering av spyttproteiner ved bruk av multipleksede mikrosfære-baserte antistoff-matriser. Monoklonale antistoffer ble kovalent bundet til fluorescerende fargestoff-kodede 4,5 um og polymer-mikrosfærer ved bruk av karbodiimid-kjemi. De modifiserte mikrokuler ble avsatt i fiberoptiske mikrobrønner for å måle proteinnivåer i spytt ved hjelp av fluorescens sandwich-immunoanalyser.
Abstract
Heri beskrives en protokoll for samtidig måling av seks proteiner i spytt ved hjelp av en fiberoptisk mikrosfære-baserte antistoff-matrisen. Den immuno-array-teknologi anvendes kombinerer fordelene med mikrokulebaserte suspensjonen matrise fabrikasjon med bruk av fluorescens-mikroskopi. Som beskrevet i video-protokollen, ble kommersielt tilgjengelig 4,5 um og polymer-mikrokuler som er kodet inn i syv forskjellige typer, differensiert av konsentrasjonen av to fluorescerende fargestoffer som er fysisk innesperret i mikrokulene. De kodede mikrokuler inneholdende overflate karboksylgrupper ble modifisert med monoklonale antistoffer fangst gjennom EDC / NHS koblingskjemi. For å montere protein microarray, de forskjellige typer av kodede og funksjonmikrokuler ble blandet og tilfeldig avsatt på 4,5 mikrometer mikrobrønner, som ble kjemisk etset ved den proksimale enden av en fiberoptisk bunt. Den fiberoptiske bunt er benyttet både som bærer og for å avbilde microspheres. Når satt sammen, ble den mikroarray som brukes til å fange proteinene i spyttet supernatanten samlet fra klinikken. Påvisningen er basert på en sandwich-immunoanalyse ved bruk av en blanding av biotinylert deteksjon-antistoffer for forskjellige analytter med et streptavidin-konjugerte fluorescerende probe, R-phycoerythrin. Den mikroarray ble fotografert ved fluorescensmikroskopi i tre forskjellige kanaler, to for mikrosfære-registrering og en for analysesignal. Fluorescens mikrografer ble så dekodet og analysert ved hjelp av en hjemmelaget algoritmen i Matlab.
Introduction
Siden den første microarray rapportert av Mark Schena og kollegaer på midten av 1990-tallet, har dette kraftige verktøyet blitt benyttet i mange felt av biologisk forskning en. Antistoff mikromatriser som er i stand til samtidig å detektere flere proteiner i diagnostiske fluider, slik som blod, har viktige anvendelser innen klinisk diagnostikk og biomarkør screening 2-10. Spytt, som inneholder mange av de samme analytter som blod, har vært betraktet som en foretrukket alternativ til blod, fordi spytt samlingen er trygt, ikke-invasiv, og kan utføres ved å minimal-trenet medisinsk personell 11-13. For tiden er multiplekset proteinanalyse ved hjelp av spyttprøver begrenset av flere viktige faktorer, blant annet den lave konsentrasjon av målanalytt 14 og det brede konsentrasjonsområdet forskjellige biomarkører 15.
.Heri viser vi analyse av seks proteiner: human vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF), interferon gamma-indusert protein 10 (IP-10), interleukin-8 (IL-8), epidermal vekstfaktor (EGF), matrisen metallopeptidase 9 (MMP-9) og interleukin-1 beta-(IL-1β) . Utførelsen av metoden ble først bekreftet ved hjelp av standardløsninger som utgjør rekombinante analyse proteiner og blokkering buffer. Ekte spyttprøver tatt fra pasienter med ulike kroniske luftveissykdommer, samt friske kontroller ble også testet med tilfredsstillende ytelse. Protokollen skal være gjeldende for andre protein analytter og andre mikrosfære-baserte analyser. Denne plattformen gir betydelige fordeler til Analytical Chemistry feltet som det muliggjør rask, nøyaktig og reproduserbar simultan analyse av lave konsentrasjoner av flere proteiner med et bredt dynamisk område, minimalt med uspesifikke interaksjoner, redusert prøven forbruk, og lav pris i forhold til en analogt Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Forskere bør betale ekstra oppmerksomhet til følgende trinn: for bedre dekoding nøyaktighet, er det nødvendig å verifisere sfærer ble homogent suspendert i alt inkubasjon og vaske trinn under sfærer koding prosedyren. I tillegg er de kodede mikrokuler må beskyttes mot lys gjennom hele eksperimentet. Etter riktig koding og lagring prosedyrer, fant vi at den samlede dekoding nøyaktighet var over 99%. De kodede sfærer bør lagres ved 4 ° C. Unngå frost og beskytte mot lys. Under riktige lagring…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (tilskudds 08UDE017788-05). EBP erkjenner også støtte fra den spanske Foundation for Science and Technology (FECYT). Forfatterne takker Shonda T. Gaylord og Pratyusha Mogalisetti for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
Riferimenti
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
