Vi presentiamo la procedura per assemblare un seme saggio di biancheria da letto di mano (SCBA) da Arabidopsis thaliana semi. La SCBA ha dimostrato di essere uno strumento potente per esplorare geneticamente e in vitro come il germinazione del seme controlli endosperma nei semi dormienti e in risposta a stimoli luminosi. L'autorespiratore in linea di principio applicabile in qualsiasi situazione in cui l'endosperma è sospettato di influenzare la crescita embrionale.
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Articolo metodologico
Un cappotto Seed Bedding Assay per esplorare geneticamente
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'endosperma Arabidopsis è costituito da un singolo strato di cellule che circonda l'embrione maturo e gioca un ruolo essenziale per impedire la germinazione dei semi dormienti o di semi nondormant irradiati da un impulso di luce rosso lontano (FR). Al fine di ottenere ulteriori informazioni sui meccanismi genetici molecolari alla base della germinazione attività repressiva esercitata dal endosperma, un saggio di "assestamento cappotto di seme" (SCBA) è stato concepito. La SCBA è una procedura di dissezione separando fisicamente tegumenti ed embrioni da semi, che consente il monitoraggio della crescita di embrioni in uno strato sottostante di cappotti di seme. Sorprendentemente, l'autorespiratore ricostituisce la germinazione attività repressive del cappotto di seme nel contesto della dormienza dei semi e di controllo FR-dipendente di germinazione dei semi. Poiché l'autorespiratore consente l'utilizzo combinatoria di dormienti, nondormant e geneticamente modificati tegumento e materiali embrionali, i percorsi genetici che controllano la germinazione e specificatamente opdendo per l'endosperma ed embrione può essere sezionato. Qui ci dettaglio la procedura per assemblare un autorespiratore.
Introduzione
In Arabidopsis semi maturi, il cappotto di seme è composto dalla testa, uno strato esterno di tessuto morto di origine materna, e l'endosperma, un singolo strato di cellule di tessuto vivo che circonda direttamente l'embrione 1. L'endosperma e l'embrione sono derivati da eventi fecondazione distinti: il endosperma è un tessuto triploide con due materna e un genoma paterno che l'embrione è un tessuto diploide con una materna e un genoma paterno 2.
La funzione principale tradizionalmente assegnato al endosperma è quello di un tessuto nutritivo. Tuttavia, è sempre più evidente che l'en....
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Protocollo
Una volta che il SCBA è assemblato, la crescita di embrioni viene monitorato per diversi giorni. Pertanto, prima della procedura di dissezione seme e montaggio del autorespiratori, si ha la necessità di sterilizzare i semi per evitare contaminazioni future che potrebbero impedire la corretta valutazione dell'effetto di materiale tegumento sulla crescita embrionale.
1. Seed Sterilizzazione
- Versare 50-60 ml di semi di Arabidopsis maturi e secchi in una provetta da 1,5 ml e preparare una soluzione di etanolo al 70%.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di etanolo al 70% per la provetta contenente i semi e agitare a ....
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Risultati
Lavoro precedente ha mostrato che i semi mutanti incapaci di sintetizzare GA erano in grado di germinare come risultato di accumulo alta ABA in semi 11,12. Tuttavia, l'incapacità di germinare richiede il cappotto di seme fin dalla sua rimozione innesca embrionale 13 la crescita. Questo indica fortemente che l'endosperma dei semi in grado di sintetizzare GA sta rilasciando ABA per bloccare la crescita embrionale. Ci aspettiamo quindi semi cappotti in grado di sintetizzare GA per bloccare la .......
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Discussione
Procedura Il test biancheria cappotto di seme (SCBA) qui descritto è in linea di principio applicabile a qualsiasi circostanza in cui la germinazione del seme di Arabidopsis è bloccato (o ritardato) e dove l'endosperma è sospettato di implementare questo arresto. Quest'ultimo può essere provata togliendo il cappotto di seme (testa e endosperma) e osservando che i proventi di crescita embrionali più veloce rispetto a quella osservata quando gli embrioni sono circondati dal tegumento. La germinazione può .......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Foundation svizzero e dallo Stato di Ginevra.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Amburgo, Germania |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Svizzera |
| Piastra per piastre di Petri (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germania |
| Murashige e Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (agar vegetale) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Paesi Bassi |
| Dumont pinze #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germania |
| Ago per siringa | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Rete di nylon (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Svizzera |
| Camera di crescita | CLF Plant Climatics | Impianto Percival I-30BLLX | CLF Climatics, Wertingen, Germania |
| Paclobutrazolo | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
Riferimenti
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plant....
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Ristampe e permessi
