Ein Mantel Bettwäsche Seed-Test zur Genetisch erkunden<em> In-vitro-</em> Wie das Endosperm Kontrollen Keimung der Samen in<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
Wir präsentieren die Prozedur, um eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) aus Arabidopsis thaliana Samen zusammenzubauen. Der Pressluftatmer wurde gezeigt, dass ein leistungsfähiges Werkzeug, um genetisch und in vitro zu erforschen, wie die Kontrollen Endosperm die Keimung der Samen in ruhenden Samen und in Reaktion auf Licht Cues. Das Atemschutzgerät ist prinzipiell anwendbar unter jeder Situation, in der Mehlkörper wird vermutet, um embryonale Wachstum beeinflussen.
Abstract
Die Arabidopsis Endosperm besteht aus einer einzigen Zellschicht um den reifen Embryo und spielt eine wesentliche Rolle, um die Keimung von ruhenden Samen oder die der nondormant Samen von einem fernen Rot (FR) Lichtpuls bestrahlt verhindern. Um weitere Einblicke in die molekularen genetischen Mechanismen, die Keimung repressive Tätigkeit des Mehlkörpers ausgeübt zugrunde liegt, wurde ein "Samenschale Bettwäsche"-Test (Pressluftatmer) entwickelt. Das Atemschutzgerät ist ein Dissektion Verfahren physische Trennung Samenschalen und Embryonen aus Samen, die es ermöglicht die Überwachung des Wachstums von Embryonen auf einer darunter liegenden Schicht der Samenschalen. Bemerkenswert ist, rekonstruiert das Atemschutzgerät die Keim repressiven Aktivitäten der Samenschale im Rahmen der Samenruhe und FR-abhängige Steuerung der Keimung der Samen. Da das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien, die genetischen Signalwege steuern Keimung und speziell optriebs im Endosperm und Embryo kann zerlegt werden. Hier werden wir ausführlich die Prozedur, um einen Pressluftatmer montieren.
Introduction
In Arabidopsis reifen Samen wird der Samenmantel der Samenschale, einer äußeren Schicht von abgestorbenem Gewebe mütterlichen Ursprungs, und der Mehlkörper, einer einzigen Zellschicht der lebenden Gewebe des Embryos ein unmittelbar umgebenden zusammen. Das Endosperm und der Embryo aus getrennten Befruchtung Ereignisse abgeleitet: das Endosperm ist ein triploid Gewebe mit zwei Müttern und einem väterlichen Genoms während das Embryo ein diploiden Gewebes mit einer Mutter und einem väterlichen Genoms 2.
Die Hauptfunktion traditionell dem Endosperm zugeordnet ist, dass ein Nährgewebe. Jedoch ist es immer deutlicher, dass das Endosperm spielt auch eine zentrale Rolle bei der Samenkeimung steuern. Dieser Begriff wurde zunächst offensichtlich im Fall der Ruhe, ein Merkmal von neu produzierten Samen ausgestellt. Ruhenden Samen nicht, trotz der Anwesenheit von günstigen Keimbedingungen keimen. Samen verlieren ihre Keimruhe nach einer Reifezeit und werden nondormant, dh sie keimen, wenn günstige Keimbedingungen ausgesetzt. In vielen Pflanzenarten, darunter der Modellpflanze Arabidopsis wird die Samenschale zwingend erforderlich, um die Keimung von ruhenden Samen zu verhindern, da die Entfernung der Samenschale löst embryonale Wachstum und Begrünung 3,4. In Arabidopsis Bethke et al. Beobachtet, dass die Keimung blieb nach dem Entfernen der Samenschale, während der Mehlkörper rund um den Mehlkörper 5 verdrängte. Diese Beobachtungen stark an, dass die Mehlkörper wird das Gewebe innerhalb der Samenschale Ausüben einer repressiven Aktivitäten auf den Embryo. Allerdings glaube Samenschale Entfernung Experimente nicht unbedingt zur Klärung der Art der Keimung repressive Aktivität durch die Samenschale vorgesehen noch die Identifizierung der Gene, die es zu implementieren.
Wir vor kurzem eine Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer), wo Samenschalen und Embryonen sind physisch getrennt, aber in enger Nähe gehaltenerklärung, so dass die Keimung repressive Aktivität durch den Mehlkörper vorgesehen ist, gehalten 6. Das Atemschutzgerät ermöglicht die Verwendung von kombinatorischen ruhend, nondormant, und genetisch veränderte Samenschale und embryonalen Materialien. Als Ergebnis können die genetischen Bahnen Steuern Keimung und spezifisch im Endosperm und Embryo-Betriebs seziert werden. Das Atemschutzgerät wurde im Rahmen der Vegetationsruhe verwendet, um zu zeigen, dass der Mehlkörper gibt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) in Richtung der Embryo seine Wachstums 6 verdrängen. Darüber hinaus wir die Pressluftatmer nutzen könnten, um die Signalwege, die in Mehlkörpers und embryonalen Geweben zu identifizieren, um Ruhe zu fördern.
Die Rolle des Endosperms, um Keimung Kontrolle wurde weiter verstärkt, indem man den Fall der nondormant Samen auf einen Impuls des fernen Rot (FR) belichtet. Frühe auf Samenquellung ein Lichtimpuls FR ist bekannt, dass die Keimung hemmen 7,8. Wenn Samenschalen wurden aus Samen entfernt einen Impuls von Licht FRwar nicht in der Lage, um die Keimung hemmen, was stark darauf hindeutet, dass der Mehlkörper können auch die Keimung von Samen nondormant 9 verdrängen. Bemerkenswerterweise kann das Atemschutzgerät auch zur FR-abhängige Hemmung der Keimung zu rekapitulieren. Dies erlaubt zu zeigen, dass die FR-abhängige Hemmung der Keimung der Samen ist auch ein Prozess, der ABA-Freisetzung aus dem Mehlkörper 9. Darüber hinaus erlaubt die Identifizierung der verschiedenen Atemschutzlichtsignalwege, die in der Mehlkörpers und der Embryo nondormant die Keimung der Samen in Reaktion auf Licht Cues 9,10 steuern.
Das Atemschutzgerät scheint daher eine zuverlässige Technik, um die Funktion des Endosperms im Rahmen der Steuerung der Samenkeimung erkunden. Es ist auch ein leistungsfähiges Werkzeug, um in vitro beurteilen, ob Gene im Verdacht, die Keimung Kontrolle arbeiten im Endosperm, Embryo oder beiden Geweben. Hier werden wir ausführlich die verschiedenen Schritte erforderlich, um eine Atemschutz montieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Samenschale Bettwäsche-Assay (Pressluftatmer) hier beschriebene Vorgehensweise ist im Prinzip auf jeder Umstand, bei dem die Keimung der Samen von Arabidopsis ist gesperrt (oder verzögert) und wo der Mehlkörper wird vermutet, diese Verhaftung zu implementieren. Letzteres kann durch Entfernen der Samenschale (Testa und Endosperm) und unter Berücksichtigung, dass embryonale Wachstum schneller verläuft relativ zu beobachten, wenn Embryonen werden von der Samenschale umgeben nachgewiesen werden. Die Keimun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Schweizerischen Nationalfonds und vom Kanton Genf unterstützt.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
Riferimenti
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
