Een zaadhuid Bedding Assay om Genetisch Explore<em> In Vitro</em> Hoe de Endosperm Controls zaadontkieming in<em> Arabidopsis thaliana</em
Summary
We presenteren de procedure om een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) monteren van Arabidopsis thaliana zaden. De MKBA bleek een krachtig instrument genetisch en in vitro onderzoeken worden hoe het endosperm controles zaadkieming slapende zaden en in reactie op licht signalen. De MKBA is in beginsel van toepassing onder elke situatie waar het endosperm wordt vermoed dat de embryonale groei beïnvloeden.
Abstract
De Arabidopsis endosperm bestaat uit een enkele cellaag rondom de rijpe embryo en speelt een essentiële rol bij de kieming van slapende zaden of van nondormant zaden bestraald door een veel rood (FR) lichtpuls voorkomen. Om inzicht te krijgen in de moleculaire genetische mechanismen ten grondslag liggen aan de kieming repressieve activiteit wordt uitgeoefend door de endosperm verder te krijgen, een "zaadhuid bedding" assay (SCBA) werd bedacht. De MKBA is een dissectie procedure fysiek te scheiden zaadvliezen en embryo's van zaden, die zorgt voor de opvolging van de groei van embryo's op een onderliggende laag van zaadvliezen. Opmerkelijk de MKBA reconstrueert de kieming repressieve activiteiten van de zaadhuid in het kader van kiemrust en FR-regeling van zaadkieming. Aangezien de MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen, de genetische wegen controlerende kieming en specifiek operating in het endosperm en embryo kan worden ontleed. Hier hebben we detail de procedure om een MKBA monteren.
Introduction
In Arabidopsis rijpe zaden, is de zaadhuid samengesteld uit de testa, een deklaag van dood weefsel afkomstig van de moeder, en het endosperm, een enkele cel laag van levend weefsel direct rondom het embryo 1. Het endosperm en het embryo zijn afgeleid van afzonderlijke bevruchting gebeurtenissen: het endosperm is een triploïde weefsel met twee moeders en een vaderlijke genoom, terwijl het embryo is een diploïde weefsel met een moeder en een vaderlijke genoom 2.
De belangrijkste functie van oudsher toegewezen aan het endosperm dat een voedings weefsel. Het wordt echter steeds duidelijker dat de endosperm speelt een centrale rol zaadkieming controleren. Deze gedachte werd eerst zichtbaar bij slaaptoestand, een eigenschap vertoond door nieuw geproduceerde zaden. Slapende zaden niet ontkiemen ondanks de aanwezigheid van gunstige kieming omstandigheden. Zaden verliezen hun rustperiode na een rijpingsperiode en word nondormant, dat wil zeggen zij zullen ontkiemen bij blootstelling aan gunstige kieming omstandigheden. In veel plantensoorten, waaronder de modelplant Arabidopsis, wordt de zaadhuid absoluut noodzakelijk om de kieming van slapende zaden voorkomen sinds zaadhuid verwijderen triggers embryonale groei en vergroening van 3,4. In Arabidopsis, Bethke et al.. Opgemerkt dat kieming bleef verdrongen na het verwijderen van de zaadhuid met behoud van het endosperm rondom het endosperm 5. Deze waarnemingen sterk aangegeven dat het endosperm is het weefsel in de zaadhuid uitoefenen van een repressieve activiteit op het embryo. Echter, zaadhuid verwijderd experimenten niet noodzakelijkerwijs te hebben de aard van de kieming repressieve activiteit door de zaadhuid of identificeren van de genen die implementeren.
We onlangs een zaadhuid beddengoed assay (SCBA) waar zaadvliezen en embryo fysiek gescheiden, maar in nauwe Proxi gehoudenMITY zodat de kiemkracht repressieve activiteit door het endosperm gehandhaafd 6. De MKBA maakt het combinatorische gebruik van slapende, nondormant, en genetisch gemodificeerde zaadhuid en embryonale materialen. Hierdoor kan de genetische leidend naar kieming en specifiek actief zijn in het endosperm en embryo worden ontleed. De MKBA werd gebruikt in het kader slaaptoestand te tonen dat het endosperm releases het plantenhormoon abscisinezuur (ABA) naar het embryo om haar groei 6 onderdrukken. Verder konden we de MKBA gebruiken om de signaalwegen die in endosperm en embryonale weefsels te identificeren kiemrust te promoten.
De rol van het endosperm ontkieming controle werd verder versterkt door te kijken bij nondormant zaden blootgesteld aan een puls van ver rood (FR) licht. Vroeg op zaad imbibitie een FR lichtpuls is bekend dat kieming 7,8 remmen. Toen zaadvliezen werden verwijderd uit zaden een puls van FR lichtkon kieming remmen sterk suggereert dat het endosperm ook onderdrukken de kieming van zaden nondormant 9. Opmerkelijk kan de MKBA worden gebruikt FR-afhankelijke remming van kieming recapituleren. Hierdoor konden aantonen dat FR-afhankelijke remming van zaadkieming ook werkwijzen waarbij ABA afgifte uit het endosperm 9. Bovendien is de MKBA toegestaan identificeren van de verschillende licht-signaalwegen die actief zijn in het endosperm en het embryo te nondormant zaadontkieming besturen in reactie op licht signalen 9,10.
De MKBA lijkt dus een betrouwbare techniek om de functie van het endosperm onderzoeken in het kader van de controle van zaadkieming zijn. Het is ook een krachtig instrument om te beoordelen in vitro of genen verdacht kieming bedienen in het endosperm, het embryo of beide weefsels. Hier hebben we detail de verschillende stappen die nodig zijn om een MKBA monteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De zaadhuid beddengoed assay (SCBA) hier beschreven procedure is in principe van toepassing op alle gevallen waarin Arabidopsis zaadontkieming is geblokkeerd (of vertraagd) en waar het endosperm wordt vermoed dat deze arrestatie te implementeren. Dit laatste kan worden aangetoond door het verwijderen van de zaadhuid (testa en endosperm) en constateren dat de embryonale groei verloopt sneller ten opzichte van die waargenomen bij embryo's worden omgeven door de zaadhuid. Kieming kan worden geblokkeerd in antw…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Zwitserse National Science Foundation en door de Staat van Genève.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | To refer |
| Thermomixer Comfort | Eppendorf AG | 5355 000.011 | Eppendorf AG, Hamburg, Germany |
| Vacusafe Comfort | INTEGRA Biosciences AG | 158 310 | Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland |
| Petri dish plate (100 mm x 20 mm) | Greiner Bio-One GmbH | 664 102 | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany |
| Murashige and Skoog | Sigma-Aldrich | M5524 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
| Agar (plant agar) | Duchefa Biochemie B.V. | P1001 | Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands |
| Dumont forceps #5 | Fine Science Tools GmbH | 11251-10 | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany |
| Syringe needle | BD Micro-Fine | 324827 | BD, Franklin Lakes, NJ USA |
| Nylon mesh (SEFAR NYTEX) | SEFAR AG | 03-50/31 | Sefar AG, Heiden, Switzerland |
| Growth chamber | CLF Plant Climatics | Percival I-30BLLX | CLF plant Climatics, Wertingen, Germany |
| Paclobutrazol | Sigma-Aldrich | 46046 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA |
Riferimenti
- Debeaujon, I., Leon-Kloosterziel, K. M., Koornneef, M. Influence of the testa on seed dormancy, germination, and longevity in Arabidopsis. Plant Physiol. 122, 403-414 (2000).
- Baroux, C., Spillane, C., Grossniklaus, U. Evolutionary origins of the endosperm in flowering plants. Genome Biol. 3, reviews1026 (2002).
- Debeaujon, I., Lepiniec, L., Pourcel, L., Routaboul, J. -. M., Bradford, K., Nonogaki, H. . Seed development, dormancy and germination. , 25-43 (2007).
- Finch-Savage, W. E., Leubner-Metzger, G. Seed dormancy and the control of germination. New Phytol. 171, 501-523 (2006).
- Bethke, P. C., et al. The Arabidopsis aleurone layer responds to nitric oxide, gibberellin, and abscisic acid and is sufficient and necessary for seed dormancy. Plant Physiol. 143, 1173-1188 (2007).
- Lee, K. P., Piskurewicz, U., Tureckova, V., Strnad, M., Lopez-Molina, L. A seed coat bedding assay shows that RGL2-dependent release of abscisic acid by the endosperm controls embryo growth in Arabidopsis dormant seeds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19108-19113 (2010).
- Reed, J. W., Nagatani, A., Elich, T. D., Fagan, M., Chory, J. Phytochrome A and Phytochrome B Have Overlapping but Distinct Functions in Arabidopsis Development. Plant Physiol. 104, 1139-1149 (1994).
- Shinomura, T., et al. Action spectra for phytochrome A- and B-specific photoinduction of seed germination in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 8129-8133 (1996).
- Lee, K. P., et al. Spatially and genetically distinct control of seed germination by phytochromes A and B. Genes Dev. 26, 1984-1996 (2012).
- Lee, K. P., Lopez-Molina, L. Control of seed germination in the shade. Cell Cycle. 11, 4489-4490 (2012).
- Piskurewicz, U., et al. The gibberellic acid signaling repressor RGL2 inhibits Arabidopsis seed germination by stimulating abscisic acid synthesis and ABI5 activity. Plant Cell. 20, 2729-2745 (2008).
- Piskurewicz, U., Tureckova, V., Lacombe, E., Lopez-Molina, L. Far-red light inhibits germination through DELLA-dependent stimulation of ABA synthesis and ABI3 activity. EMBO J. 28, 2259-2271 (2009).
- Debeaujon, I., Koornneef, M. Gibberellin requirement for Arabidopsis seed germination is determined both by testa characteristics and embryonic abscisic acid. Plant Physiol. 122, 415-424 (2000).
- Sun, T. P., Kamiya, Y. The Arabidopsis GA1 locus encodes the cyclase ent-kaurene synthetase A of gibberellin biosynthesis. Plant Cell. 6, 1509-1518 (1994).
- Alonso, J. M., et al. Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis thaliana. Science. 301, 653-657 (2003).
- Rook, F., et al. Impaired sucrose-induction mutants reveal the modulation of sugar-induced starch biosynthetic gene expression by abscisic acid signalling. Plant J. 26, 421-433 (2001).
