En Seed Coat Bedding analysen til Genetisk Utforsk<em> In Vitro</em> Hvordan stivelse Controls frø spiring i<em> Arabidopsis thaliana</em

Summary

Vi presenterer fremgangsmåten for å sette sammen en frøhylsteret sengetøy analysen (SCBA) fra Arabidopsis thaliana frø. Den SCBA ble vist seg å være et kraftig verktøy for å utforske genetisk og in vitro hvordan stivelse kontroller frø spiring i sovende frø og i respons til lys signaler. Den SCBA er i prinsippet som gjelder under noen situasjon der det er analysert er mistenkt for å påvirke embryonale vekst.

Abstract

Den Arabidopsis endosperm består av et enkelt cellelag som omgir det modne embryo og spille en viktig rolle for å forhindre spiring av frø i hvilende tilstand eller som av nondormant frø bestrålt av en langt rød (FR) lyspuls. For ytterligere å få innsikt i de molekylære genetiske mekanismene bak spiring undertrykkende aktivitet utøves av stivelse, ble en "seed coat bedding" analysen (SCBA) utviklet. Den SCBA er en disseksjon prosedyre fysisk skille frø strøk og embryoer fra frø, som tillater overvåking veksten av embryo på et underliggende lag av frø strøk. Bemerkelsesverdig, rekonstruerer SCBA spiring undertrykkende aktiviteter av frø pels i sammenheng med frø dvalen og FR avhengig styring av frø spiring. Siden SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer, de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opMed drifts i endosperm og embryo kan bli dissekert. Her har vi detalj prosedyren for å sette sammen en SCBA.

Introduction

I Arabidopsis modne frø, blir frø pels bestående av testa, et ytre lag av dødt vev av maternal opprinnelse, og endosperm, en enkelt celle laget av levende vev direkte omgir embryoet ^1. Stivelse og embryoet er utledet fra separate befruktning hendelser: stivelse er en triploid vev med to mødre og en faderlig genomet mens fosteret er en diploid vev med en mors og en fars genom ^to.

Hovedfunksjonen som tradisjonelt er tilordnet stivelse er at av en næringsverdi vev. Imidlertid er det stadig tydeligere at stivelse spiller også en sentral rolle for å kontrollere frø spiring. Denne forestillingen ble først synlig i tilfellet uvirksom, en egenskap som utvises av nylig produserte frø. Dormant frø unnlater å spire til tross for tilstedeværelsen av gunstige spirebetingelser. Frø mister dvalen etter en modningsperioden og bli nondormant, dvs. de vil spire når de utsettes for gunstige spireforhold. I mange plantearter, inkludert modell anlegg Arabidopsis, er frøet pelsen helt nødvendig for å hindre spiring av sovende frø siden frøhylsteret fjerning utløser embryonale vekst og Greening ^3,4. I Arabidopsis, Bethke et al. Observert at spiring forble trykt etter å ha fjernet testa samtidig opprettholde stivelse rundt endosperm ^fem. Disse observasjoner indikerte at stivelse er vevet i frøhylsteret utøve en undertrykkende aktivitet på embryoet. Men ikke seedet frakk fjerning eksperimenter ikke nødvendigvis hjelpe å avklare innholdet av spiring undertrykkende aktivitet gitt av frøet pelsen heller identifisere genene som implementerer den.

Vi har nylig introdusert et frø frakk sengetøy analysen (SCBA) hvor frø strøk og embryoer er fysisk atskilt, men holdt i nært Proxistemmelse slik at spiring undertrykkende aktivitet gitt av stivelse er opprettholdt ^seks. Den SCBA tillater kombi bruk av sovende, nondormant, og genmodifiserte frø pels og embryonale materialer. Som et resultat, kan de genetiske trasé kontrollerende spiring og spesielt opererer i endosperm og embryoet blir dissekert. Den SCBA ble brukt i sammenheng med dvalen for å vise at stivelse utgivelser phytohormone abscisic syre (ABA) mot fosteret å undertrykke sin vekst ^seks. Videre kunne vi bruke røykdykker å identifisere signalveier som opererer i endosperm og embryonale vev for å fremme dvalen.

Rollen av stivelse for å kontrollere spiring ble ytterligere styrket ved å vurdere saken på nondormant frø utsatt for en puls på langt rødt (FR) lys. Tidlig på frø imbibition en FR lys puls er kjent for å hemme spiring ^7,8. Når sette strøk ble fjernet fra frøene en puls av FR lysetvar ute av stand til å hemme spiring, sterkt tyder på at stivelse kan også undertrykke spiring av nondormant frø ^ni. Bemerkelsesverdig, kan det overtrykk også brukes til å rekapitulere FR-avhengig inhibering av spiring. Denne lov til å vise at at FR avhengig hemming av frø spiring er også en prosess som involverer ABA utgivelse fra stivelse ^ni. Videre røykdykker tillot identifisering av de forskjellige lys-signalveier som opererer i endosperm og embryoet for å styre nondormant frøspiring som reaksjon på lys signaler ^9,10.

Den med overtrykk ser derfor ut til å være en pålitelig teknikk for å utforske funksjon av stivelse i forbindelse med kontroll av frøspiring. Det er også et kraftig verktøy for å bedømme in vitro vidt gener som mistenkes for å styre spiring operere i endosperm, embryo eller begge vevene. Her har vi detalj de ulike trinnene som kreves for å sette sammen en SCBA.

Protocol

Når røykdykker er satt sammen, blir veksten av embryoer overvåkes i løpet av flere dager. Derfor, før frøet disseksjon prosedyre og montering av røykdykker, trenger man å sterilisere frø for å unngå fremtidige forurensninger som kan hindre skikkelig vurdering av effekten av frø pels materiale på embryonale vekst. En. Seed Sterilisering Hell 50-60 mL av modne og tørre Arabidopsis frø i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube og forberede en 70% etanol løsning. …

Representative Results

Tidligere arbeid har vist at mutant frø som ikke kan syntetisere GA ikke var i stand til å spire som et resultat av høy ABA akkumulering i frø 11,12. Men manglende evne til å spire krever frøhylsteret siden fjerning utløser embryonale vekst 13. Dette indikerte at sterkt endosperm av frø som ikke kan syntetisere GA slipper ABA å blokkere embryonisk vekst. Vi forventer derfor frø strøk klarer å syntetisere GA å blokkere veksten av embryo i en SCBA motsetning frø strøk klarer å synteti…

Discussion

Frøet strøk sengetøy analysen (SCBA) prosedyre som er beskrevet her er i prinsippet som gjelder til enhver omstendighet hvor Arabidopsis frø spiring er blokkert (eller forsinket) og hvor stivelse er mistenkt for å implementere denne arrestasjonen. Sistnevnte kan være dokumentert ved å fjerne frø pels (testa og stivelse) og observere at embryonale veksten fortsetter raskere i forhold til det som er observert når embryoer er omgitt av frøet pelsen. Spiring kan blokkeres i respons på bestemte miljø fys…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	To refer
Thermomixer Comfort	Eppendorf AG	5355 000.011	Eppendorf AG, Hamburg, Germany
Vacusafe Comfort	INTEGRA Biosciences AG	158 310	Integra Biosciences AG, Zizers, Switzerland
Petri dish plate (100 mm x 20 mm)	Greiner Bio-One GmbH	664 102	Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany
Murashige and Skoog	Sigma-Aldrich	M5524	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
MES	Sigma-Aldrich	M3671	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA
Agar (plant agar)	Duchefa Biochemie B.V.	P1001	Duchefa Biochemie, Haarlem, Netherlands
Dumont forceps #5	Fine Science Tools GmbH	11251-10	Fine Science Tools GmbH, Heidelberg Germany
Syringe needle	BD Micro-Fine	324827	BD, Franklin Lakes, NJ USA
Nylon mesh (SEFAR NYTEX)	SEFAR AG	03-50/31	Sefar AG, Heiden, Switzerland
Growth chamber	CLF Plant Climatics	Percival I-30BLLX	CLF plant Climatics, Wertingen, Germany
Paclobutrazol	Sigma-Aldrich	46046	Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA