Identifikation af metabolisk aktive bakterier i tarmen af generalist<em> Spodoptera littoralis</em> Via DNA stabile isotoper Probing Brug<sup> 13</sup> C-glucose
Summary
Den aktive bakterielle samfund er forbundet med tarmen hos Spodoptera littoralis, blev bestemt ved stabil isotop-probe (SIP) koblet til pyrosekventering. Ved hjælp af denne metode blev identifikation af metabolisk aktive bakteriearter i samfundet gjort med høj opløsning og præcision.
Abstract
Tarme af de fleste insekter beboet af komplekse samfund af symbiotiske patogene bakterier. Inden for sådanne mikrobielle samfund er det muligt at identificere kommensale eller mutualistic bakteriearter. Sidstnævnte dem, er blevet observeret til at tjene flere funktioner til insektet, dvs hjælper i insekt reproduktion 1, øge immunresponset 2 feromon produktion 3, samt ernæring, herunder syntesen af essentielle aminosyrer 4, blandt andre.
På grund af vigtigheden af disse foreninger, er blevet gjort mange bestræbelser på at karakterisere de samfund ned til de enkelte medlemmer. Men de fleste af disse bestræbelser blev enten baseret på dyrkningsmetoder eller påberåbt sig den generation af 16S rRNA-genet fragmenter, der blev sekventeret til endelig identifikation. Desværre er disse metoder kun identificeret bakteriearter til stede i tarmen, og forudsat at der ikke information den metaboliske aktivitet af mikroorganismer.
At karakterisere de metabolisk aktive bakteriearter i tarmen af et insekt, brugte vi en stabil isotop sondering (SIP) in vivo beskæftiger 13 C-glucose som en universel substrat. Dette er en lovende kultur-fri teknik, der tillader binding af mikrobielle fylogenier deres særlige metaboliske aktivitet. Dette er muligt ved at spore stabile isotopmærkede atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, såsom DNA og RNA 5. Inkorporeringen af 13C-isotoper i DNA øger densiteten af det mærkede DNA i forhold til det umærkede (12 C) en. I sidste ende er det 13C-mærkede DNA eller RNA separeret ved densitetsgradient ultracentrifugering fra 12 C-mærket tilsvarende ét 6. Efterfølgende molekylær analyse af de separerede nukleinsyre isotopomers tilvejebringer forbindelsen mellem metabolisk aktivitet og identitet af arten.
Her præsenterer vi den protokol, der bruges til at karakterisere de metabolisk aktive bakterier i tarmen af en generalist insekt (vores model-system), Spodoptera littoralis (Lepidoptera, Ugler). Den fylogenetisk analyse af DNA blev udført under anvendelse af pyrosekventering, hvilket gav høj opløsning og præcision i identifikationen af insekt gut bakteriel samfund. Som vigtigste substrat blev 13C-mærket glucose, der anvendes i forsøgene. Substratet blev tilført til insekter ved hjælp af en kunstig diæt.
Introduction
Insekt-bakterielle symbiotiske foreninger er kendt for et stort antal insektarter 7. I disse symbiotiske foreninger, mikroorganismer spiller en vigtig rolle i vækst og udvikling af insekter. Mikrober har vist sig at bidrage til insekt reproduktion 1 feromon biosyntese 3, ernæring, herunder syntese af essentielle aminosyrer 4, og fordøjelse af utilgængelig fødevarer til værten. Trods det store udvalg af tarm-bakterie foreninger er langt mindre kendt om den funktionelle rolle, de spiller til fordel for insekt. Kun i tilfælde af termitter, symbiotisk fordøjelse af lignocellulose udføres af prokaryoter, protozoer og svampe, er blevet bredt undersøgt 8,9. I modsætning til dette, er lidt om det symbiotiske association til stede i tarmen af generalist insekter dvs bomuld leafworm, Spodoptera littoralis. Som følge af deres hyppige skift af plante værter, generelist insekter og deres tarmassocierede bakterielle samfund er permanent udsat for nye udfordringer i forbindelse med deres fodring vaner forbrugende planter med et væld af fytokemikalier. Udover dette, tarmen miljø Lepidoptera'er udgør i sig selv et barsk miljø for vækst af bakterier på grund af den høje tarm pH 10. Især i tilfælde af S. littoralis, det varierer fra 10,5 i foregut, ca. 9 i mellemtarmen til pH næsten 7 i stortarmen 11. På den anden side, den bakterielle samfund er forbundet med tarmen S. littoralis er enkel. Tang, Freitak, m.fl. 12. Rapporteret højst 36 phylotypes tilhører alt 7 forskellige bakteriearter, som de eneste medlemmer af den bakterielle samfund er forbundet med denne insekt. Ud over dette er ikke kompliceret procedure opdræt kræves for væksten insekt i laboratoriet. Desuden er denne og den korte livscyklus insekt lette multi-generational undersøgelser, vender denne art i en ideel model for at studere gut-mikrobe interaktioner.
Med fremkomsten af PCR-baserede sekventering teknologier, er antallet af undersøgelser, der beskæftiger sig med tarm biota af adskillige organismer (dvs. mennesker, insekter eller marine organismer) øges. Desuden er resultaterne uafhængige af isolering og dyrkning af tarmen nærede bakterier i fortiden. Næsten 99% af bakterier er ikke dyrkbare og er vanskelig 12 simulering af de miljømæssige forhold i tarmen. Ved hjælp af PCR, kunne 16S rRNA-genet fragmenter (en udbredt fylogenetisk genmarkør blandt bakterier) selektivt amplificeret fra en blandet DNA-skabelon af tarmen bakterielle samfund, sekventeret og klonet. Med denne information, brugeren er i stand til at identificere de bakteriearter efter hentning sekvensen oplysninger fra offentlige databaser 13,14. Alligevel sekventering tilgange til at beskrive bakterielsamfund fortsat utilstrækkelig på grund af manglende oplysninger om den iboende metaboliske bidrag af de enkelte arter inden for fællesskabet.
Stabil-isotop sondering (SIP) er en lovende kultur-fri teknik. Det er ofte brugt i miljø mikrobiologi til at analysere mikrobielle fylogenier knyttet til særlige metaboliske aktiviteter. Dette opnås ved at spore stabile isotopmærkede atomer fra substrater til mikrobielle biomarkører, såsom phospholipid-afledte fedtsyrer, DNA og RNA 5. Når man overvejer nukleinsyrer den metode, der er baseret på adskillelse af 13C-mærket DNA eller RNA fra den umærkede DNA ved densitetsgradient ultracentrifugering 6. På grund af denne direkte forbindelse mellem DNA etiketten og metabolisk aktivitet, en nedstrøms molekylær analyse af nukleinsyrerne identificerer arten og giver information om metaboliske aktiviteter. Desuden kombination af DNA-SIP og pyrosekventering som anvendt afPilloni von Netzer et al. 15. tillader en særlig enkel og følsom identifikation af bakteriearter til stede i den tunge 13C-mærkede DNA-fraktion. Indtil nu er denne teknik blevet anvendt til at beskrive de bakterielle samfund involveret i biokemiske processer i jorden under aerobe 16,17 og anaerobe betingelser 18,19. Udover anvendelsen i miljøvidenskab er teknikken blevet anvendt i medicinske videnskaber som rapporteret af Reichardt, et al. 5, der beskrev de metaboliske aktiviteter i forskellige fylogenetiske grupper af den menneskelige tarm mikrobiota som reaktion på en ufordøjelig kulhydrat.
Her bruger vi 13C-glucose til "etiket" DNA'et af metabolisk aktive bakteriearter i tarmen. Glucose er en sukker anvendt af de fleste bakteriearter langs udbredt Entner-Doudoroff (ED) pathway, selv om undtagelser er kendte 20. Detretfærdiggør brugen af 13C-glucose som en pålidelig metabolisk sonde, der giver en sammenhæng mellem metabolitter af interesse og kulstof kilde langs etablerede veje. Afhængigt af de videnskabelige spørgsmål andre substrater, dvs 13C-methan, 13 CO 2 eller planter opdrættet under en 13 CO2-atmosfære, kan anvendes til at behandle metaboliske aktiviteter.
På dette tidspunkt, vi præsenterer den protokol, der anvendes i den metaboliske karakterisering af tarmen bakterielle samfund af en generalist insekt, nemlig S. littoralis (Lepidoptera, Noctuidae). Desuden blev den teknik koblet til Pyrosequencing, hvilket muliggør identifikation af insekt gut bakteriel samfund med høj opløsning og præcision. Da det primære substrat blev 13C-mærket glucose anvendt under forsøgene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tarmen hos de fleste insekter rummer en rig og kompleks mikrobielle samfund, typisk 10 7 -10 9 prokaryote celler indgive der, outnumbering værtens egne celler i de fleste tilfælde. Således insekt tarmen er et "hot spot" for forskellige mikrobielle aktiviteter, repræsenterer mange aspekter af mikrobielle relationer, fra patogenese at forpligte mutualisme 27. Selv om mange undersøgelser har beskrevet et fantastisk udvalg af insekt gut mikrobielle samfund, karakterisering af …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Angelika Berg til laboratorie assistance. Dette arbejde blev støttet og finansieret af Max Planck Society og Jena School for Mikrobiel Kommunikation (JSMC).
Materials
| Dumont #5 Mirror Finish Forceps | Fine Science Tools | 11251-23 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Speed Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf Germany | 5305 000.304 | |
| Plastic pestle | Carl Roth GmbH Co. Germany | P986.1 | |
| NanoVue spectrophotometer | GE HealthCare, UK | 28-9569-58 | |
| Mastercycler pro/thermocycler | Eppendorf Germany | 6321 000.515 | |
| Agagel Standard Horizontal Gel Electrophoresis chamber | Biometra | Discontinued | |
| Ultracentrifuge (Optima L-90K) | Beckman | A20684 | |
| Ultracentrifuge rotor (NVT 90) | Beckman | 362752 | |
| HPLC pump | Agilent | 1100 | |
| Quick-Seal, Polyallomer tube | Beckman | 342412 | |
| Transilluminator UVstar 15 | Biometra |
Riferimenti
- Pais, R., Lohs, C., Wu, Y. N., Wang, J. W., Aksoy, S. The obligate mutualist Wigglesworthia glossinidia influences reproduction, digestion, and immunity processes of its host, the tsetse fly. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5965-5974 (2008).
- Freitak, D., Heckel, D. G., Vogel, H. Dietary-dependent trans-generational immune priming in an insect herbivore. Proc. Biol. Sci. 276, 2617-2624 (2009).
- Dillon, R. J., Vennard, C. T., Charnley, A. K. A Note: Gut bacteria produce components of a locust cohesion pheromone. J. Appl. Microbiol. 92, 759-763 (2002).
- Douglas, A. E. Nutritional interactions in insect-microbial symbioses: Aphids and their symbiotic bacteria Buchnera. Annu. Rev. Entomol. 43, 17-37 (1998).
- Reichardt, N., Barclay, A. R., Weaver, L. T., Morrison, D. J. Use of stable isotopes to measure the metabolic activity of the human intestinal microbiota. Appl. Environ. Microbiol. 77, 8009-8014 (2011).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
- Gil, R., Latorre, A., Moya, A. Bacterial endosymbionts of insects: insights from comparative genomics. Environ. Microbiol. 6, 1109-1122 (2004).
- Brune, A., VH, R. e. s. h., Cardé, R. T. . Encyclopedia of Insects. , 1132 (2005).
- Breznak, J. A., Brune, A. Role of microorganisms in the digestion of lignocellulose by termites. Annu. Rev. Entomol. 39, 453-487 (1994).
- Broderick, N. A., Raffa, K. F., Goodman, R. M., Handelsman, J. Census of the bacterial community of the gypsy moth larval midgut by using culturing and culture-independent methods. Appl. Environ. Microbiol. 70, 293-300 (2004).
- Funke, M., et al. Rapid hydrolysis of quorum-sensing molecules in the gut of lepidopteran larvae. Chembiochem. 9, 1953-1959 (2008).
- Tang, X. S., et al. Complexity and variability of gut commensal microbiota in polyphagous lepidopteran larvae. PloS One. 7, (2012).
- Amann, R. I., Ludwig, W., Schleifer, K. H. Phylogenetic identification and in-situ detection of individual microbial-cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59, 143-169 (1995).
- Olsen, G. J., Lane, D. J., Giovannoni, S. J., Pace, N. R., Stahl, D. A. Microbial ecology and evolution – a ribosomal-rna approach. Annu. Rev. Microbiol. 40, 337-365 (1986).
- Pilloni, G., von Netzer, F., Engel, M., Lueders, T. Electron acceptor-dependent identification of key anaerobic toluene degraders at a tar-oil-contaminated aquifer by Pyro-SIP. FEMS Microbiol. Ecol. 78, 165-175 (2011).
- Lu, Y. H., Conrad, R. In situ stable isotope probing of methanogenic archaea in the rice rhizosphere. Science. 309, 1088-1090 (2005).
- Radajewski, S., Ineson, P., Parekh, N. R., Murrell, J. C. Stable-isotope probing as a tool in microbial ecology. Nature. 403, 646-649 (2000).
- Lueders, T., Pommerenke, B., Friedrich, M. W. Stable-isotope probing of microorganisms thriving at thermodynamic limits: Syntrophic propionate oxidation in flooded soil. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5778-5786 (2004).
- Kunapuli, U., Lueders, T., Meckenstock, R. U. The use of stable isotope probing to identify key iron-reducing microorganisms involved in anaerobic benzene degradation. ISME J. 1, 643-653 (2007).
- Fuhrer, T., Fischer, E., Sauer, U. Experimental identification and quantification of glucose metabolism in seven bacterial species. J. Bacteriol. 187, 1581-1590 (2005).
- Dunford, E. A., Neufeld, J. D. DNA Stable-Isotope Probing (DNA-SIP). J. Vis. Exp. (42), (2010).
- Yamasaki, S., Nomura, N., Nakajima, T., Uchiyama, H. Cultivation-independent identification of candidate dehalorespiring bacteria in tetrachloroethylene degradation. Environ. Sci. Technol. 46, 7709-7716 (2012).
- Lueders, T., Manefield, M., Friedrich, M. W. Enhanced sensitivity of DNA- and rRNA-based stable isotope probing by fractionation and quantitative analysis of isopycnic centrifugation gradients. Environ. Microbiol. 6, 73-78 (2004).
- Ishak, H. D., et al. Bacterial diversity in Solenopsis invicta and Solenopsis geminata ant colonies characterized by 16S amplicon 454 pyrosequencing. Microb. Ecol. 61, 821-831 (2011).
- Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Tag-encoded FLX amplicon pyrosequencing for the elucidation of microbial and functional gene diversity in any environment. Methods Mol. Biol. 733, 129-141 (2011).
- Kuczynski, J., et al. Using QIIME to Analyze 16S rRNA Gene sequences from microbial communities. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1, Unit1E 5 (2012).
- Dillon, R. J., Dillon, V. M. The gut bacteria of insects: nonpathogenic interactions. Annu. Rev. Entomol. 49, 71-92 (2004).
- Neufeld, J. D., et al. DNA stable-isotope probing. Nat. Protoc. 2, 860-866 (2007).
- Dumont, M. G., Murrell, J. C. Stable isotope probing – linking microbial identity to function. Nat. Rev. Microbiol. 3, 499-504 (2005).
