Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника Published: October 22, 2013 doi: 10.3791/50741
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Faculty of Infectious & Tropical Diseases, London School of Hygiene & Tropical Medicine

Summary

Выполнение анализа клеточной культуры для исследования бактериальной адгезии и инвазии в аэробных условиях, как правило, не представляющий

Abstract

Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками-хозяевами были широко исследованы использованием методов пробирке культуре клеток. Однако, поскольку такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, в пробирке эти модели не могут точно представлять в естественных условиях среды, в которой хозяин-патоген взаимодействия происходят. Мы разработали в пробирке модель инфекции, которая позволяет совместное культивирование бактерий и клеток-хозяев в различных средних и газа условий. Вертикальные диффузионной камеры (VDC) модель имитирует условия в кишечнике человека, где бактерии будут в условиях очень низкой в ​​то время как ткани кислородом будет снабжаться кислородом из крови. Размещение поляризованного кишечные эпителиальные клетки (МЭК) монослоя, выращенных в Snapwell вставки в пост создает отдельные апикальной и базолатеральным отсеков. Базолатеральной отделение заполнено среде клеточной культуры, герметизируют и перфузии кислорода безhilst апикальной отсек заполнен бульон, остается открытым и инкубировали в микроаэробных условиях. Оба Caco-2 и T84 IECS могут быть сохранены в постоянного тока в этих условиях без всякой видимой пагубные последствия для выживания клеток монослоя или целостности. Сокультивирования эксперименты, проведенные с различными C. джеджуни штаммы дикого типа и различных линий IEC в модели постоянного тока с микроаэробных условий в апикальной отсек воспроизводимо привести к увеличению числа взаимодействующих (почти в 10 раз) и внутриклеточные (почти в 100 раз) бактерий по сравнению с аэробных условиях культивирования 1. Среды, созданной в модели постоянного тока более точно имитирует среду, с которыми сталкиваются C. джеджуни в кишечнике человека и подчеркивает важность выполнения анализов в пробирке инфекции в условиях, которые более точно имитировать в естественных условиях реальности. Мы полагаем, что использование модели постоянного тока позволит новые интерпретации взаимодействий ставкуWeEn бактериальных патогенов, и клетки-хозяева.

Introduction

Взаимодействие бактериальных патогенов с клетками-хозяевами были широко исследованы использованием методов пробирке культуре клеток. Использование таких клеточных культур, бактериальной адгезии к клеткам хозяина, определение рецепторов клетки-хозяина, клетки-хозяина сигнальных путей и бактериальной инвазии клеток-хозяев, все были подробно изучены, в результате чего многие важные наблюдения. Однако такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, которые не могут быть представителем в естественных условиях окружающей среды. Главное ограничение в пробирке модели, используемые для изучения желудочно-кишечных инфекций в том, что условия культивирования включая высокий уровень кислорода в целом одобряют эукариотических выживания клетки. Однако условия в просвете кишечника будет почти анаэробных. Кишечных патогенов в очень низкой кислородной среде выразить гены вирулентности, экспрессия которых изменения в аэробных условиях 2. Таким образом, данные, полученные с использованием стандартных клеточных культур моделях май дают неточные указания бактериального взаимодействия с клетками-хозяевами.

Campylobacter джеджуни является ведущим возбудителем бактериального острого гастроэнтерита по всему миру, с симптомами, которые варьируются от легкой диареи до тяжелых воспалительных энтерита. Большинство С. джеджуни инфекции приводят в неосложненных гастроэнтерита, однако C. джеджуни также, наиболее часто упоминаемой инфекционного агента в периферические невропатии, включая синдром Гийена-Барре (СГБ). В Великобритании, по оценкам, насчитывается более 500 000 случаев энтерита вызванных C. джеджуни инфекции каждый год с прогнозируемой стоимостью в экономику Великобритании в размере £ 580 000 000. В развивающихся странах, C. джеджуни является ведущей причиной смертности среди детей. Несмотря на несомненную важность инфекции Campylobacter и десятилетия исследований, в том числе тщательное геномики на основе анализа, C. джеджуни патогенеза еще плохо understООД, в отличие от других кишечных патогенов, таких как сальмонелла, кишечная палочка, шигеллы, и холерный вибрион. Отсутствие удобных маленькая модель животного одна из главных причин для этого 3. Также широко используется в моделях пробирке инфекции более подходит для изучения микроаэрофильная C. джеджуни, чем для других кишечных патогенных микроорганизмов, которые являются факультативными анаэробами. Хотя C. джеджуни признан инвазивного возбудителя, механизмы C. джеджуни вторжения в эпителиальные клетки кишечника (IECS) до сих пор неясны 4,5. C. джеджуни вторжение было показано, зависит от или микрофиламентов, микротрубочек, сочетание оба или ни 5. Путаницы в этой области, скорее всего, за счет использования ненадлежащих условиях в пробирке анализа.

Ряд различных анализах культуры клеток были использованы для исследования взаимодействия С. джеджунис клетками-хозяевами. Caco-2, 6, 7 INT 407 и T84 8 клеточные линии все были использованы для изучения адгезии и инвазии возможностей различных C. джеджуни штаммов. Однако уровни бактериальной адгезии и инвазии для C. джеджуни с IECS значительно ниже, чем для других кишечных патогенов 9. Сокультивирования С. джеджуни с IECS обычно выполняется в СО 2-инкубаторе в условиях, близких к атмосферному уровня кислорода, необходимого для выживания IECS. C. джеджуни экспрессии генов будет сильно отличаться в среде с низким кислородом просвет кишечника по сравнению с атмосферным условиям кислорода.

Использование вертикальной диффузионной камеры (VDC) была разработана система, которая позволяет совместное культивирование бактерий и клеток-хозяев в различных средних и газа условиях 1,10,11. Эта система имитирует условия в кишечнике человека, где бактерии будет ООНдер условиях очень низких ткани в то время как кислород будет снабжаться кислородом из крови. Поляризованные монослоев IEC выращивают в специальных фильтров 0,4 мкм помещали в создании постоянного тока апикальной и базолатеральной отсек, которые были индивидуально заполнены бактериальный бульон и среды культуры клеток соответственно (рис. 1). В постоянного тока помещали в атмосферу переменной инкубаторе, содержащем 85% N 2, 5% O 2 и 10% CO 2 при 37 ° С, представляя оптимальные условия для C. джеджуни. Верхушечный отсека осталась открытой и подверженной микроаэробных атмосфера в переменной атмосферу инкубатора, в то время как запечатанные базолатеральным отсек снабжаются кислородом постоянным введением 5% CO 2/95% O 2 газовой смеси с выходной трубкой предотвращения накопления давления . Сасо-2 выживание клеток и монослой целостность при этих условиях были подтверждены путем мониторинга трансэпителиальная элементctrical сопротивления (TEER) через монослой в течение 24 часов, чтобы продемонстрировать выживаемость клеток Сасо-2 монослой клеток и физическое разделение апикальной и базолатеральной отсеков в условиях низкой кислорода в апикальной отсека. TEER монослоев в ДКР поддерживается в переменной атмосфере инкубатора (микроаэробных условий) и в стандартной клеточной культуры CO 2-инкубаторе (аэробных условиях) не показали значительных различий, что указывает на целостность монослоя клеток при различных атмосферных условиях 1. В микроаэробных условиях плотных соединений остался настоящим и равномерно распределены между границами ячеек с помощью рисунка окклюдина окрашивания похожи на клетки поддерживаются в аэробных условиях 1.

Взаимодействия C. джеджуни с Caco-2 и T84 клеток в VDC были исследованы оценки взаимодействия бактериальных (адгезия и инвазия) и вторжения. Два разных C. джеджуни дикого типа Straiнс были использованы 1. C. джеджуни 11168H является hypermotile производной исходного штамма NCTC11168 последовательности. 11168H штамм демонстрирует гораздо более высокие уровни колонизации в модели колонизации кур и, таким образом, рассматриваться в качестве подходящего штамма использовать для хозяин-патоген исследования взаимодействия. 81-176 является человеком изолировать и является одним из наиболее широко изученных инвазивных лабораторных штаммов. С. джеджуни штаммы были добавлены к апикальной отсеке постоянного тока в соответствии либо микроаэробных или аэробных условиях. Мы наблюдали более высокие ставки для взаимодействия и вторжения были записаны для C. джеджуни в микроаэробных условия 1. Повышенная C. джеджуни взаимодействия не за счет увеличения числа бактерий в микроаэробных условия 1. Эти данные подтверждают нашу гипотезу, что низкая среде кислорода в апикальной отсеке VDC улучшает бактерии-хозяина взаимодействий и показывает, что инвазивные свойства C. джеджуни являются INCRоблегчили в этих условиях. Это было первое сообщение об использовании модели постоянного тока для изучения инвазивных бактериальных патогенов и подчеркивает важность выполнения анализов в пробирке инфекции в условиях, которые более точно имитировать в естественных условиях ситуации. Модель постоянного тока может быть использована для изучения хозяин-патоген взаимодействия для различных видов бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Рост Монослои IEC на специальные фильтры 0,4 мкм

  1. Культуры клеток Сасо-2 в модифицированной, по существу Дульбекко среды Игла (DMEM) с добавлением 10% (об / об) фетальной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 1% (об / об), заменимые аминокислоты в стандарт культуре ткани инкубаторе при 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздуха. Семенной 4 х 10 5 Сасо-2 IECS за 0,4 мкм фильтр и расти к поляризации более 21 дней, заменяя СМИ каждые 2-3 дня.
  2. Измерьте TEER для подтверждения статуса поляризации монослоя использованием Вольт Ом сопротивления метр. В наших исследованиях, TEER из 21 день Сасо-2 клетки, выращенные в этих фильтрах 0,4 мкм составляет 700-800 Ом · см 2.

2. Подготовка C. джеджуни и бактериальные Среда для анализа сокультивирования

  1. 24 ч до желаемую исходную точку анализа сокультивирования VDC, подготовить новую тарелку кровяной агар С. джеджуни и инкубировать при 37 ° С в микроаэробных условия (85% N 2, 5% O 2 и 10% СО 2) в атмосфере переменной инкубатора.
  2. В то же время, preincubate 30 мл бруцелл бульоне при 37 ° С в микроаэробных условий в переменной атмосфере инкубатора.

3. Подготовка и стерилизация палат VDC Половина До анализа

  1. Полностью погрузить постоянного тока половина камеры, а также уплотнительные кольца и пробки в стерилизации раствора.
  2. Используя стерильный шприц 20 мл, промойте стерилизации раствора через входы газа в обе половины камер. Невыполнение этого требования может привести к загрязнению образцов при сокультивирования.
  3. Оставьте все компоненты, погруженных в раствор стерилизации в течение> 1 часа.
  4. Тщательно промойте все компоненты со свежим стерильной водой, используя другую стерильную 20 мл шприц для промывки газа заливов.

4. Подготовкабактериального Посевной

  1. Урожай половину тарелки C. джеджуни роста от пластины кровяной агар подготовлены в предыдущий день в 1 мл бульона предварительно инкубированной бруцелл. Это должно дать ~ 10 10 КОЕ / мл.
  2. Измерение оптической плотности бактериальной суспензии при 600 нм в semiquantify бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ).
  3. Регулировка бактериальной суспензии до нужного уровня инокулята в 4 мл предварительно инкубированной бульоне Brucella.
  4. Выполнение серийных разведений этого окончательного бактериальной суспензии последующим покрытием из соответствующих разведений в чашках с кровяным агаром в трех экземплярах, а затем инкубируют при 37 ° С в атмосфере переменной инкубаторе в течение 48 часов для количественного определения количества бактериальных КОЕ присутствует в инокулята.

5. Настройка VDC

  1. Поместите нижнюю палату VDC плоские на скамью. Установите уплотнительное кольцо на нижнюю половину камеры.
  2. Снимите один фильтр проведения IECS от TОн носитель и вымыть три раза с 400 мкл стерильной PBS. Поместите фильтр на нижнюю половину камеры, убедившись, что уплотнительное кольцо остается на месте.
  3. Аккуратно опустите верхнюю палату половина на месте. После двух половин камеры собран, зажимают между собой с помощью кольцевого зажима. Поместите VDC горизонтально на настольный, с двумя отверстиями вверх.
  4. Добавить 4 мл бактериальной посевной в апикальной половине камеры.
  5. Добавить 4 мл клеточной культуральной среде в базолатеральной камеры наполовину.
  6. Поместите конец части в отверстия по обе половины камер.

6. Прикрепление VDC к газовый коллектор в переменной Атмосфера инкубатор

  1. Поместите постоянного тока в переменный атмосфере инкубаторе в непосредственной близости от газовой магистрали.
  2. Открыть регулятор газа соединены с газовым коллектором. Прикрепите трубу от коллектора в газовую входе на базолатеральной камеры половины постоянного тока. Прикрепить GAс выпускной трубой, ведущей из переменной атмосферы инкубатора к одной из торговых точек в конечной части на камеру базолатеральным половину.
  3. Закройте другой выход в наконечник на базолатеральной камере половину. Откройте газовый поток на газовом коллекторе, заботясь, чтобы открыть его очень медленно, чтобы избежать избыточного давления газа, так как это может привести к изгнанию базолатеральную среду.
  4. Цель состоит в газовом потоке 1 пузырь каждые 2-5 сек. Периодически проверять на газовый поток в ходе эксперимента и при необходимости отрегулировать.

7. Разборка VDC после Coculture

  1. После соответствующего периода совместного культивирования, закройте регулятор газа подключен к газовой магистрали. Закрыть подачу газа в постоянного тока на коллекторе. Отключите газа на входе, выходе газа и пробку из постоянного тока.
  2. Удалить пост из переменной атмосферы инкубатора. Удалить апикальной и базолатеральным супернатантами и хранить при температуре -80 ° С в течение subsequenT анализа.
  3. Снимите кольца зажима и осторожно разобрать постоянного тока. Снимите фильтр с камеры и передачи половины в стерильную 6-и блюдо культуре клеток. Промыть IECS три раза 400 мкл стерильного PBS.
  4. Для перечисление общее количество взаимодействующих бактерии, добавляют 400 мкл стерильного PBS, содержащим 0,1% (об / об) Тритона X-100 до IECS и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре, чтобы лизировать МЭК. Выполнение серийных разведений этого клеточный лизат последующим покрытием из соответствующих разведений в чашках с кровяным агаром в трех экземплярах, а затем инкубируют при 37 ° С в атмосфере переменной инкубаторе в течение 48 часов для количественного определения количества взаимодействующих бактериальных КОЕ.
  5. Для перечисление общего числа вторжения бактерий, добавляют 400 мкл DMEM культуральной среды, содержащей 150 мкг / мл гентамицина в IECS и инкубируют в течение 2 ч в стандартном культуре ткани инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% СО 2 и 95% воздух, чтобы убить бактерии внеклеточной,следуйте за шагом 7,4 выше.

8. Очистка VDC после Coculture

Вымойте VDC стерильной водой и хранят для следующего раунда экспериментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сокультивирования экспериментов, выполненных с С. джеджуни штамма дикого типа и IECS в модели постоянного тока с микроаэробных условий в апикальной отсек продемонстрировали увеличение числа взаимодействующих (почти в 10 раз) и внутриклеточные (почти в 100 раз) бактерий по сравнению с аэробных условиях культивирования в момент -зависимым способом 1. Это наблюдение было воспроизводимым с помощью двух различных C. джеджуни штаммы дикого типа (11168H и 81-176) и двух различных линий IEC (ЦАС-2 и T84), подчеркнув применимости модели постоянного тока 1.

Репрезентативные результаты, представленные здесь, сравнение между количеством С. джеджуни открывая или вторжения клетки Сасо-2 через 3, 6 или 24 ч сокультивирования соответствии либо стандартных клеточных культур в условиях анализа СО 2 инкубатора (рис. 2А и В), либо в модели с VDC микроаэробных условия в апикальной COMотсек (рис. 2С и D). Данные для двух различных C. джеджуни штаммы дикого типа (11168H и 81-176) представлены. В соответствии со стандартной клеточной культуре условий, используемых в подавляющем большинстве исследований в научной литературе, <10 7 КОЕ наблюдалось взаимодействия с клетки Сасо-2 (2А) по сравнению с ~ 10 8 КОЕ наблюдалось взаимодействия с клетки Сасо-2 в VDC модели (рис. 2С) после 24 часов. После совместного культивирования в модели В, ~ 10 7 КОЕ внутриклеточный были выделены из клеток Сасо-2 (фиг. 2D), по сравнению с только ~ 10 5 КОЕ внутриклеточный изолированы от клеток Сасо-2 (фиг. 2В) после совместного культивирования при стандартных условиях культивирования клеток в течение 24 часа в сутки.

Прямое сравнение между числом C. джеджуни открывая или вторжение IECS после совместного культивирования в модели постоянного тока или с микроаэробных или аэробных условияхных в апикальной отсек был выполнен ранее 1. Использование результатов постоянного тока модели к увеличению взаимодействующих С. джеджуни почти в 10 раз и увеличение внутриклеточного С. джеджуни почти в 100 раз после 24 часов совместного культивирования 1.

Рисунок 1
Рисунок 1. Схема вертикальной диффузионной камеры (VDC) модели. Эпителиальных клетках кишечника (IECS) выращивают на проницаемой 0,4 мкм фильтр поддерживает и вставляется в пост, тем самым создавая апикальной и базолатеральным отсека. Эти отсеки могут регулироваться индивидуально в отношении средних и состава газа, чтобы позволить сокультивирования из IECS с С. джеджуни с микроаэробных условий на апикальной поверхности IECS и аэробных условиях при базолатеральной поверхности IECS.


Рисунок 2. Представитель результаты сравнения количества C. джеджуни 11168H или 81-176 штаммов дикого типа взаимодействует с (А и С) или вторжения (В и D) клетки Сасо-2 часа после того, как 3, 6 или 24, когда совместное культивирование анализ проводили в соответствии либо стандартных условиях культуры клеток в СО 2-инкубаторе (А и В), либо в модели с VDC микроаэробных условия в апикальной отсека (С и D). Все эксперименты представляют по крайней мере три биологических повторяет проводятся дважды в каждом эксперименте. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование в пробирке методами клеточной культуры для изучения взаимодействия бактериальных патогенов с клетками-хозяевами является метод широко используется во многих исследовательских лабораториях. Однако, поскольку такой анализ культуры клеток в аэробных условиях, в пробирке эти модели не могут точно представлять в естественных условиях среды, в которой хозяин-патоген взаимодействия происходят. Широко используется в моделях пробирке инфекции особенно подходят для изучения микроаэрофильная C. джеджуни по сравнению с другими кишечных патогенов, которые являются факультативными анаэробами. Существует большая путаница в литературе о механизмах вторжение человека IECS К. джеджуни 4,5. Мы полагаем, что причиной вторжения механизмы так плохо понимал в том, что в пробирке моделей, используемых в этих исследованиях не точно отражают ситуацию в естественных условиях. С помощью стандартных анализов клеточных культур, уровеньС. джеджуни вторжения IECS всегда очень низко 9. Разработка модели VDC был наш ответ на решение этой проблемы.

Мы установили, что две различные линии IEC могут быть сохранены в = с микроаэробных условия на апикальной поверхности без каких-либо наблюдаемых эффектов невыгодно над периодом 24 часа 1. Зависящих от времени увеличение численности как взаимодействующие и внутриклеточных С. джеджуни 11168H бактерии дикого типа штамма наблюдается после сокультивирования с Сасо-2 IECS В постоянного тока с микроаэробных условия в апикальной отделение 1. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены с использованием второго IEC линии (T84), а также второй C. джеджуни штамма дикого типа (81-176), что указывает на отсутствие клеточной линии или бактериального штамма специфических эффектов 1. Эти увеличенные уровни взаимодействия бактериальных и вторжение привело к увеличению, поляризованный врожденного иммунного ответа от IECS 1. Герметический интегрирующий гироскопее уровни IL-8 были обнаружены после микроаэробных сокультивирования, что свидетельствует о повышенной заражение бактериями будет сопровождаться повышенным ответ хозяина. Более высокие уровни IL-8 были обнаружены в супернатантах сравнению базолатеральной к апикальной супернатантов, указывая, что IL-8 секреции IECS происходит преимущественно от базолатеральной поверхности IEC. IL-8 в качестве аттрактанта нейтрофилов, которые были бы ограниченное применение в просвете кишечника. Эти данные показывают, что два блочную установку постоянного тока также обеспечивает эффективную идентификацию поляризованный ответа хозяина.

Некоторые особенности в отношении технических / настройки стороне модели постоянного тока необходимо учитывать до применения модели для изучения любого патогенного организма. Во-первых, IECS должны быть выращены с образованием непроницаемого монослой на специальных 0,4 мкм фильтр. Это занимает от 14-21 дней в зависимости от клеточной линии использовали и делает эксперименты довольно длительный по сравнению с классическими cocultuКольцо экспериментов, выполненных в виде пластин культуре клеток и использование IECS выращивают в течение 1-7 дней. С другой стороны, только после такого длительного периода роста IECS было продемонстрировано с образованием полностью поляризованного монослоя. Такие поляризованного монослоя имитировать ситуацию в естественных условиях в организме человека кишечный эпителий гораздо более тесно, чем неполяризованного, nonconfluent линии IEC использованы в некоторых исследованиях и, таким образом обеспечивают еще одно преимущество модели постоянного тока. Во-вторых, специальные фильтры 0,4 мкм значительно дороже, чем стандартный 24-луночный планшет культуре клеток. Основным ограничением постоянного тока является относительно низкая пропускная способность. В основном это связано с наличием постоянного тока камеры и требующих установки газовой магистралью. Лишь сравнительно небольшое число параллельных репликации могут быть выполнены в одно время, в отличие от классического метода клеточной культуры. Модель постоянного тока поэтому менее пригоден для крупномасштабного скрининга экспериментов или экспериментов, требующих высокого числа одинаковыхTES. Другим фактором является то, что гравитационный эффект совместного культивирования выполнении анализов в модели постоянного тока означает, что более бактерий времени начинают агрегировать в нижней части апикальной отсек что приводит к снижению возможности для взаимодействия с монослоем МЭК. Тем не менее, используя модель постоянного тока, мы показали, что взаимодействие неподвижные, nonaggregating 11168H rpoN мутанта резко уменьшается по сравнению с подвижностью, агрегирования 11168H штамма дикого типа после 6 ч. 1. В настоящее время мы работаем над изменениями к модели постоянного тока, что позволило бы некоторым смешиванием в апикальной отсек, в котором было бы более точно имитировать перистальтики в просвете кишечника. Таким образом, в то время как модель постоянного тока лучше, чем классические, аэробные культуры клеток методами из-за более близко имитирует ситуацию в живом организме, особенно для бактерий, таких как C. джеджуни, которые имеют строгие требования атмосферного, модель постоянного тока все еще ​​имеет некоторые ограничения, которые должны быть принятыво внимание при разработке экспериментов.

Наши данные подтверждают выводы, содержащиеся для аналогичной модели постоянного тока используется для изучения человеческого желудка Helicobacter Pylori патоген, который показал увеличился бактериальной адгезии к клеткам хозяина, повышенный синтез бактериальных факторов вирулентности, а также повышенный хозяина врожденного иммунного ответа, когда H. Pylori была культивировали совместно с эпителиальных клеток в микроаэробных сравнению с аэробных условиях 11. Поскольку оба H. Pylori и C. джеджуни требуют микроаэробных условия для роста, открытие того, что микроаэробных условия способствуют взаимодействию организмов с клетками-хозяевами неудивительно. Однако в другом исследовании с использованием системы постоянного тока для анализа взаимодействий факультативных анаэробных Энтерогеморрагическая кишечной палочки с IECS показали повышенные уровни бактериальной взаимодействие в анаэробных / микроаэробных совместное культивирование в условиях постоянного тока апикальной отсек 10. Tего указывает, что поведение бактерий, которые способны пролиферировать при атмосферном давлении кислорода также изменяется, когда культивируют совместно с IECS в анаэробных / микроаэробных условиях. Это говорит о том, что модель постоянного тока представляет собой улучшенный и полезной моделью для анализа хозяин-патоген взаимодействий различных патогенных бактерий в условиях, которые более точно напоминают в естественных условиях ситуация в просвете кишечника человека.

С точки зрения модели, модель VDC оказалась обладают некоторыми явными преимуществами перед аэробными в пробирке C. джеджуни-IEC сокультивирования моделей. Среды, созданной в модели постоянного тока более точно имитирует среду в кишечнике человека в течение C. джеджуни инфекции, что приводит к весьма значительному увеличению количества бактерий взаимодействуют и вторжение IECS. Модель постоянного тока в этом текущий формат идеально подходит для изучения взаимодействия кишечных бактерий желудка или кишечникаэпителиальные клетки, но есть потенциал, чтобы адаптировать VDC модель для изучения строгих анаэробов из проб стула или для устных микробиологических образцов, а всего лишь два примера. Важным принципом всегда должна быть, чтобы стремиться выполнять эти эксперименты совместного культивирования в условиях, которые более точно имитировать ситуацию в естественных условиях. Модель постоянного тока станет важным инструментом для дальнейших исследований C. джеджуни хозяин-патоген взаимодействий и должны быть применимы к изучению патогенетических механизмов много различных бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Доминик Миллс была поддержана Bloomsbury колледжей PhD студенчества (2007-2010). Авторы хотели бы поблагодарить и Озан Gundogdu и Абди Elmi за их помощь в разработке модели постоянного тока.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Speciality vertical diffusion system for use with Snapwell inserts Harvard Apparatus 66-0001 Manifold & six Snapwell chambers
Caps Harvard Apparatus 66-0020
O-rings Harvard Apparatus 66-0007
Clamps Harvard Apparatus 66-0012
Snapwell filters (pore size 0.4 μm) Corning Costar 3407
Millicell ERS-2 Volt-Ohm resistance meter Millipore MERS00002
WPA Lightwave II spectrophotometer Biochrom 80-3003-72

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mills, D. C., et al. Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment. Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).
  2. Marteyn, B., et al. Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo. Nature. 465, 355-358 (2010).
  3. Dorrell, N., Wren, B. W. The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems. Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).
  4. Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis. Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).
  5. Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. Campylobacter. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).
  6. Everest, P. H., et al. Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli. J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).
  7. Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures. Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).
  8. Monteville, M. R., Konkel, M. E. Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface. Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).
  9. Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms. J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).
  10. Schuller, S., Phillips, A. D. Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells. Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).
  11. Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling. J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).

Tags

Инфекция выпуск 80 грамотрицательные бактерии бактериальные инфекции желудочно-кишечные заболевания, Бактериальной инвазии эпителиальные клетки кишечника моделях инфекции
Кишечные бактериальной инвазии эпителиальных клеток кишечника<em&gt; In Vitro</em&gt; Резко усиливается с помощью вертикальной модели диффузионной камере
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Naz, N., Mills, D. C., Wren, B. W.,… More

Naz, N., Mills, D. C., Wren, B. W., Dorrell, N. Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model. J. Vis. Exp. (80), e50741, doi:10.3791/50741 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter