Identifikation DNA-mutationer i renset hæmatopoietisk stamcelletransplantation / stamceller

Summary

Her beskriver vi en in vivo-mutagenese analyse for et lille antal af oprensede hæmatopoietiske celler ved anvendelse af LacI transgene musemodel. LacI genet kan isoleres til at bestemme frekvens, placering og type af DNA mutanter spontant opstået eller efter udsættelse for genotoxins.

Abstract

I de senere år er det blevet klart, at genomisk instabilitet stramt er relateret til mange udviklingsmæssige forstyrrelser, kræft og aldring. Da stamceller er ansvarlig for at sikre vævshomeostase og reparation gennem hele livet, er det rimeligt at gætte på, at stamceller befolkning er afgørende for at bevare genomisk integritet af væv. Derfor har betydelig interesse opstået i vurderingen af ​​virkningen af ​​endogene og miljømæssige faktorer på genomisk integritet i stamceller og deres afkom, for at forstå ætiologien af ​​stamcelle baserede sygdomme.

Laci transgene mus bære en erstattes λ fag-vektor, der koder LacI reporter system, hvor LacI-genet fungerer som mutationen reporter. Resultatet af en muteret LacI-genet er produktionen af β-galactosidase, som spalter et chromogent substrat, dreje det blå. LacI reportersystemet udføres in alle celler, herunder stamceller / stamceller og kan let genvindes og anvendes til efterfølgende at inficere E. coli. Efter inkubering inficerede E. coli på agarose der indeholder den korrekte substrat kan plaque scores, blå plakker indikerer en mutant LacI-genet, mens tydelige plaques harbor vildtype. Hyppigheden af ​​blå (blandt klar) plaques angiver mutanthyppigheden i den oprindelige cellepopulation DNA blev ekstraheret fra. Sekventering mutant LacI genet, vil vise placeringen af mutationer i genet og typen af mutation.

LacI transgene musemodel er veletableret som en in vivo-mutagenese assay. Desuden mus og reagenserne til assayet er kommercielt tilgængelige. Her beskriver vi i detaljer, hvordan denne model kan være indrettet til at måle frekvensen af spontant forekommende DNA-mutanter, stamcelle-beriget Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) celler og andre underpopulationer af det hæmatopoietiske system.

Introduction

I de fleste væv, differentierede celler har en begrænset levetid. For at opretholde funktionelle integritet, langlivede, vævs-specifikke stamceller kontinuerligt producere stamceller, som til gengæld giver anledning til den fuldt differentierede celler, der er nødvendige for funktionen af ​​det pågældende væv. Stamceller også genopbygge deres eget rum gennem en proces kaldet selv-fornyelse. Således stamceller er ansvarlige for at opretholde den funktionelle integritet af vævet, de bor i. Derfor er det bydende nødvendigt, at de er udstyret med robuste mekanismer til at sanse og potentielt reparere beskadiget DNA. Hvis ikke, kan de erhverve flere genomiske (potentielt skadelig) forstyrrelser, som kan blive arvet af deres afkom. Forstå, hvordan stamceller safe-guard deres genom i levetiden for en organisme er et vigtigt spørgsmål, og kan hjælpe os med at forstå, hvorfor genomisk instabilitet er forbundet med kræft og nogle andre aldersrelaterede sygdomme (revideret i ^1,2).

<p class = "jove_content"> Kontrol genomisk integritet væv ved niveauet for stamceller eller tidlige progenitor cellepopulationer kan opnås ved enten at fjerne defekte stamceller (eller progenitor-celler) via celledød, fremadskridende alderdom eller differentiering og / eller ved effektiv reparation af beskadiget DNA. Nylige undersøgelser har vist, at det er muligt at måle visse former for DNA-reparation ikke direkte i disse sjældne populationer ^3-6. Det blev konstateret, at for eksempel i hæmatopoietiske system, dobbeltstrenget DNA pauser kan repareres ved homolog rekombination (HR) eller ikke-homolog ende sammenføjning (NHEJ), hvor sidstnævnte er en reparation proces lavere nøjagtighed, og dermed øget risiko for at fejl. Begge bliver udnyttet i bloddannende stamceller (HSCs) ^4,5, men i mus det synes det er overvejende NHEJ i HSCs mens tidlige stamceller udnytte HR ^4. En lignende observation blev lavet til stamceller i huden ^6.. Interessant i human HSCs HR, ikke NHEJ,synes at være ophelingsmekanismen valg for dobbeltstrengede brud ^3. Hvorvidt dette funktionelle forskel mellem de to arter er ægte eller blot repræsenterer en teknologisk eller eksperimentel forskel er endnu uvist.

En stamcelle repertoire til at reparere beskadiget DNA er sandsynligvis til at omfatte andre DNA reparation mekanismer, såsom bunden excision reparation (BER), nukleotid excision reparation (NER) og fejlparringsreparation (MFR). BER og NER er ansvarlige for at reparere en enkelt eller flere basepar læsioner i enkeltstrenget DNA, mens MFR rettelser basis-basefejlparringer og indsættelse / sletning loops, disse typer af DNA-skader kan ikke repareres af NHEJ eller HR. Støtte dette begreb er flere undersøgelser fra hæmatopoietiske system viser en sammenhæng mellem ændringer i en af disse veje og abnormiteter i HSC rum ^7-9, samt en øget risiko for udvikling myelodysplastisk syndrom ^10-16, en sygdom, der stammer iHSC, og som er forbundet med stigende genomisk ustabilitet som sygdommen skrider frem ^17. Som i endnu, ikke er blevet rapporteret målinger af BER, NER, og MFR direkte i HSCs.

Ud over at belyse de forskellige processer, der styrer vævs integritet på en mekanistisk niveau, er det nødvendigt at være i stand til at måle omfanget af muterede DNA, således at konsekvenserne af aberrationer i én af disse processer kan testes, f.eks normal versus genetisk manipuleret stamceller eller i gamle kontra unge. Det er imidlertid vanskeligt på grund af mangel på vævsspecifikke stamceller og manglen på dyrkningsbetingelser, der bevarer "stemness" udvikling af et relevant assay. Desuden bør en sådan analyse kunne ændres til miljømæssige og genetiske manipulationer. En mulig løsning på disse begrænsninger og krav, er brugen af ​​musemodeller, som er specifikt udviklet til at detektere DNA-mutationer.

Mulmultiplum transgene musemodeller for mutationsdetektion er blevet udviklet. For eksempel LacI transgene mus ¹⁸ bære en erstattes λ fag-vektor, der koder LacI reporter system, hvor LacI-genet koder for et suppressor af Lac operatøren og tjener som mutationen reporter. Ved mutation af LacI-genet, lac-operatoren aktiveret og β-galactosidase er produceret. β-galactosidase spalter det kromogene substrat X-gal (5-brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), som omdanner det blå. Cos flankerer LacI vektor tillader nem inddrivelse ved lambdafag proteiner og efterfølgende infektion af E. coli. Efter inkubering inficerede E. coli på agarose, der indeholder X-gal-substrat kan plaque scores. Blå plader indeholder en formodet mutant Lac-I bærer fagen, mens tydelige plaques harbor ikke-mutanter. Hyppigheden af ​​blå plaques (blandt the klare dem) angiver mutanthyppigheden i den oprindelige cellepopulation DNA blev ekstraheret fra. Desuden kan λ-fag vært LacI målet let sekventeres ved anvendelse af PCR-teknikker til relativt højt gennemløb analyse. Sekventering af flere mutant Laci gener vil afsløre vigtige informationer om mutationen spektrum, hvilket igen kan pege på eventuelle mangler i specifikke DNA reparation veje eller specifikke genotoksiske begivenheder. LacI transgene system er blevet standardiseret på tværs af flere laboratorier ¹⁹ og reagenser findes i handelen. En væsentlig ulempe ved LacI-systemet, er den begrænsede evne til at detektere store deletioner eller rearrangementer, og derfor andre metoder, f.eks flerfarvede FISH på metafasespredninger skal bruges til at komplimentere denne mangel.

Inden for λ-fag vektor LacI musemodel, der er et meget mindre genet CII, Til rådighed for mutationsanalyse. Dens størrelse og det faktum, at der kan vælges mutanter gør dette til en mindre arbejdskrævende og billigere assay ²⁰ end LacI genanalyse. Imidlertid er LacI-genet mere grundigt undersøgt til mutagenese ²¹ og følsomheden af genet mutationer er blevet godt karakteriseret, så at der er en klar forståelse af de aminosyrerester, der genererer en fænotypisk reaktion på et kromogent substrat ^22-25.

Andre musemodeller for mutationsdetektion omfatter anvendelse af ΦX174 eller LacZ transgener. Den ΦX174 transgene mus model, med den oprindelige A: T → G: C tilbagefald mutation assay ²⁶ eller fremad mutation assay ^27, der tillader detektering af et spektrum af basepar udskiftninger, repræsenterer et billigere system end LacI modellen. Men mutational skærmen i fremad assayet er ikke trivielt, og mutationen spectrum af ΦX174 transgenet er ikke så godt karakteriseret som for LacI. I musemodeller bærer LacZ transgener er LacZ mutations reporter udvindes udnytte E. coli værtsceller, der er følsomme over for galactose og medium indeholdende galactose ^28. En ulempe ved dette system er, at inddrivelsen af LacZ mål indebærer også restriktionsendonucleasefordøjelse efterfulgt af ligatur og elektroporation af E. coli vært, hvilket gør det vanskeligt at tilpasse systemet til et lille antal celler. Selvom det ikke er et absolut krav for at arbejde med stamceller / stamceller populationer (man kan altid starte med flere mus), hvis et stort antal celler er påkrævet (f.eks millioner eller mere) vil det hurtigt blive upraktisk og omkostningseffektive uoverkommelige. Også den relativt store størrelse af LacZ, men samtidig give en følsom mutational reporter, er besværligt og dyrere for DNA-sekvens analyse og determgennemgang af mutation spektre. En stor fordel ved denne model er imidlertid dens evne til at detektere store deletioner og insertioner samt kromosomale omlejringer.

Eftersom alle celler i LacI, ΦX174 og LacZ transgene musemodeller bære reporter system, kan nogen af disse musemodeller anvendes til at måle mutagenese i en celletype af interesse, herunder stamceller og progenitorceller, så længe de kan pålideligt høstes og i tilstrækkeligt antal. Fordi vi havde stor erfaring med LacI musemodel og LacI mutation assay, besluttede vi at forfølge denne ordning yderligere for mutagenese analyse i hæmatopoietiske stamceller og progenitorpopulationer.

Hæmatopoietisk væv er godt karakteriseret i form af celleoverfladen fænotype af de enkelte bestanddele, herunder langsigtede repopulariserende stamceller, som kan identificeres som den yderst sjælden population af Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– celler ^29. . Mohrin m.fl. ⁴ viste, at lidt større population af LSK/Flk2 ^– celler er stadig gode repræsentanter for HSCs og signifikant forskellig fra den mest primitive engagerede myeloid stamfader (CMP) befolkning, når det kommer til at studere DNA-reparation. Desuden, når HSC-berigede LSK (Flk-2 ⁺ og Flk-2 ^-) celler blev sammenlignet med Lin ^– IL7R ^– Sca-1-cKit ^{+ +} (LS-K stamceller), var der stadig en betydelig forskel i NHEJ evne ⁵ mellem mindre rent, stamcelle-beriget LSK befolkning og progenitorceller. I vores undersøgelse bruger vi HSC-beriget LSK (Flk-2 ⁺ og Flk-2 ^-) celler, fordi vi fandt, at der kræves mindst 2 x 10 ⁵ celler til konsekvente, pålidelige resultater i denne mutagenese assay; denne celle nummer er yderst vanskeligtat opnå, når man sorterer LSK/Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 befolkning eller endda LSK/Flk2 ^– befolkning (i form af mus, omkostninger og funktionalitet). Denne protokol, der er baseret på den ene oprindeligt udviklet af Kohler et al. ¹⁸ beskriver i detaljer, hvordan den spontane DNA mutanthyppigheden kan bestemmes i LSK celler og defineret populationer af differentierede myeloide celler samt usorteret knoglemarv og milt celler.

Protocol

Leukocytter fra LacI transgene mus på en C57BL / 6 baggrund ikke udtrykker Sca-1 (figur 1). Derfor, hvis Sca-1 er en markør, der anvendes til celle rensning, behøver disse mus, der skal krydses med en passende belastning for at opnå Sca-1-ekspression, i denne protokol F1 af en krydsning mellem regulære C57BL / 6 (B6) mus og LacI (C57BL / 6) transgene mus (LacI) blev anvendt (fig. 1). Af de cellepopulationer anvendes i denne protokol, LSKs og kystforvaltni…

Representative Results

In vivo mutagenese assay måler en sjælden begivenhed (mutant PFU'er) blandt mange hændelser (alle PFU'er). Ved at udføre analysen med lille antal celler, er det muligt, at resultatet bliver væsentligt påvirket af falsk positive og falsk negative resultater. For at løse dette problem, vi udførte en seriel fortynding eksperiment med fraktionerede knoglemarvsceller, der er høstet fra tre forskellige dyr. Vi målte mutanthyppigheden i knoglemarven af disse dyr under anvendelse af 1,4 x 10 <su…

Discussion

In vivo-mutagenese-assay beskrevet heri er baseret på LacI transgene musemodel oprindeligt blev genereret af Kohler et al. ^18. Denne model anvender en λ-fag vektor, der bærer en lacl reportergen. De to cos flankerer vektoren giver mulighed for en relativt simpel genvinding og efterfølgende pakning i infektiøse fagpartikler, anvendes til at inficere E. coli. En blå plak vil blive genereret ved fag-inficerede E. coli, der indeholder et muteret…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880