Het identificeren van DNA-mutaties in Gezuiverd hematopoietische stamcellen / progenitorcellen

Summary

Hier beschrijven we een in vivo mutagenese test voor kleine aantallen hematopoietische cellen gezuiverd met de Lacl transgene muismodel. De Lacl gen kan worden geïsoleerd om de frequentie, locatie en soort DNA mutanten spontaan ontstaan ​​of na blootstelling aan genotoxinen bepalen.

Abstract

De laatste jaren is gebleken dat genomische instabiliteit nauw gerelateerd aan vele ontwikkelingsstoornissen, kanker en veroudering. Gezien het feit dat stamcellen zijn verantwoordelijk voor weefselhomeostase en reparatie gedurende het hele leven, is het redelijk om te veronderstellen dat de stamcel populatie is van cruciaal belang voor het behoud van genomische integriteit van de weefsels. Daarom is er aanzienlijke belangstelling ontstaan ​​bij de beoordeling van de impact van de endogene en omgevingsfactoren op genomische integriteit in stamcellen en hun nakomelingen, gericht op de etiologie van stamcel-ziekten te begrijpen.

Lacl transgene muizen dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reporter systeem, waarbij de Lacl gen dient als mutatie reporter. Het resultaat van een gemuteerd Lacl gen de productie van β-galactosidase, dat een chromogeen substraat klieft, draaien blauw. De LacI reporter systeem is uitgevoerd in alle cellen, met inbegrip van stam / voorlopercellen en kan eenvoudig worden teruggewonnen en gebruikt vervolgens infecteren E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de juiste substraat bevat, kan plaques worden gescoord; blue plaques wijzen op een mutant LacI gen, terwijl heldere plaques haven wild-type. De frequentie van blauwe (onder duidelijke) plaques geeft de mutatiefrequentie in de oorspronkelijke celpopulatie het DNA werd geëxtraheerd uit. Sequencing van de gemuteerde Lacl gen zal de locatie van de mutaties in het gen en het soort mutatie vertonen.

De LacI transgene muismodel is goed ingesteld als een in vivo mutagenese test. Bovendien, de muizen en de reagentia voor de test zijn commercieel verkrijgbaar. Hier beschrijven we in detail hoe dit model kan worden aangepast aan de frequentie van spontaan optredende mutanten DNA stamcellen verrijkte Lin meten ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) cellen en andere subpopulaties van het hematopoietische systeem.

Introduction

In de meeste weefsels, gedifferentieerde cellen hebben een beperkte levensduur. Om functionele integriteit, langlevende, weefselspecifieke stamcellen continu produceren progenitorcellen die op hun beurt aanleiding geven tot de volledig gedifferentieerde cellen vereist voor de functie van dat weefsel. Stamcellen hun eigen compartiment vullen ook door een proces genaamd zelfvernieuwing. Aldus stamcellen zijn verantwoordelijk voor de functionele integriteit van het weefsel waaruit ze wonen inch Daarom is het noodzakelijk dat ze uitgerust met robuuste mechanismen te voelen en mogelijk repareren beschadigd DNA. Anders kan deze meerdere genomische (mogelijk schadelijke) verstoringen, die worden overgenomen door hun nageslacht te verkrijgen. Inzicht in hoe stamcellen vrijwaren hun genoom tijdens de levensduur van een organisme is een belangrijke vraag en kan ons helpen begrijpen waarom genomische instabiliteit is verbonden met kanker en andere ouderdomsziekten (beoordeeld in ^1,2).

<p class = "jove_content"> Controlling genomische integriteit van een weefsel op het niveau van stamcellen of voorlopercellen vroege celpopulaties kan worden bereikt door ofwel het elimineren defecte stam (of progenitor cellen) via celdood, senescentie of differentiatie en / of efficiënte reparatie van beschadigd DNA. Recente studies hebben aangetoond dat het mogelijk is bepaalde DNA herstel direct deze zeldzame populaties ^3-6 meten. Er werd gevonden dat bijvoorbeeld in het hematopoietische systeem, dubbelstrengs DNA breuken kunnen worden gerepareerd door homologe recombinatie (HR) of niet-homologe eind mee (NHEJ), waarbij de laatste een reparatieproces lagere betrouwbaarheid en dus meer kans maken fouten. Beide worden gebruikt in hematopoietische stamcellen (HSC's) ^4,5, maar in muizen lijkt het overwegend NHEJ in HSC terwijl vroege voorlopercellen cellen te gebruiken HR ^4. Een vergelijkbare waarneming werd gedaan voor stamcellen in de huid ^6. Interessant is dat in menselijke HSCs HR, niet NHEJ,lijkt het herstelmechanisme van de keuze voor dubbelstrengsbreuken ³ zijn. Of dit functioneel verschil tussen de twee species echt is of slechts vertegenwoordigt een technologische of experimentele verschil nog te bezien.

Repertoire Een stamcel om beschadigd DNA te repareren waarschijnlijk andere DNA herstel mechanismen, zoals base excisie reparatie (BER), nucleotide excisie reparatie (NER) en mismatch repair (MMR) bevatten. BER en NER zijn verantwoordelijk voor het repareren van een of meerdere basenparen laesies in enkelstrengs DNA, terwijl MMR fixes base-base mismatches en insertie / deletie lussen, deze vormen van DNA-schade niet kan worden gerepareerd door NHEJ of HR. Ondersteunende dit begrip verschillende onderzoeken van het hematopoëtische systeem het verband aantoont tussen veranderingen in een van deze wegen en afwijkingen in de HSC compartiment ^7-9, en een verhoogd risico op myelodysplastisch syndroom ^10-16, een ziekte die ontstaat in deHSC en dat bij hogere genomische instabiliteit als de ziekte vordert ^17. Tot nu toe, hebben metingen van BER, NER, en MMR direct HSC niet gemeld.

Naast het ophelderen van de verschillende processen die weefselintegriteit op een mechanistische niveau beheersen, is het noodzakelijk om in staat om de mate van gemuteerde DNA te meten, waardoor de gevolgen van afwijkingen in een van deze processen kunnen worden getest, bijvoorbeeld in normale versus genetisch gemanipuleerde stamcellen of in oud versus jong. De ontwikkeling van een relevante assay is moeilijk vanwege het gebrek aan weefselspecifieke stamcellen en het ontbreken van kweekomstandigheden die "stemness" behoudt. Bovendien moet een dergelijke test wijzigbaar milieu en genetische manipulaties. Een mogelijke oplossing voor deze beperkingen en eisen is het gebruik van muismodellen die specifiek zijn ontworpen om DNA-mutaties te detecteren.

Multiple transgene muismodellen voor mutatiedetectie zijn ontwikkeld. Bijvoorbeeld LacI transgene muizen ¹⁸ dragen een herstelbare λ faag coderend voor het Lacl reportersysteem, waarbij de Lacl gen codeert voor een suppressor van Lac operator en dient als de mutatie reporter. Na mutatie van het Lacl gen, is de Lac operator geactiveerd en β-galactosidase geproduceerd. β-galactosidase splitst het chromogene substraat X-gal (5-broom-4-chloor-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), die blauw wordt. De cos plaatsen aan weerszijden van de LacI vector maakt een eenvoudige herstel door lambdafaag eiwitten en de daaropvolgende infectie van E. coli. Na incubatie geïnfecteerde E. coli op agarose dat de X-gal substraat bevat, kan plaques worden gescoord. Blauwe plaques bevatten een vermeende mutant Lac-I dragende faag, terwijl heldere plaques haven niet-mutanten. De frequentie van blauwe plaques (onder the duidelijk zijn) geeft de mutant frequentie in de oorspronkelijke cel bevolking het DNA werd geëxtraheerd uit. Bovendien kan de faag λ gastheer van de Lacl doel gemakkelijk worden gesequenced met behulp van PCR-technieken relatief hoge doorvoer analyse. Sequencing meerdere gemuteerde LacI genen zullen belangrijke informatie over de mutatie spectrum, die op hun beurt kunnen wijzen op eventuele tekortkomingen in specifieke DNA repair pathways of om specifieke genotoxische gebeurtenissen onthullen. Het Lacl transgene systeem is gestandaardiseerd verschillende laboratoria ¹⁹ en reagentia zijn commercieel verkrijgbaar. Een groot nadeel van het Lacl systeem is de beperkte mogelijkheid om grote deleties of herschikkingen detecteren, daarom, andere methoden, zoals multi-color FISH metafase smeersels moeten worden gebruikt om deze tekortkoming complimenteren.

Binnen de λ faag vector van de Lacl muismodel er een veel kleinere gen, CII, Beschikbaar voor mutatie analyse. De omvang en het feit dat mutanten kunnen worden gekozen maakt dit een minder arbeidsintensief en goedkoper assay ²⁰ dan de Lacl gen analyse. Echter, de Lacl gen uitvoeriger bestudeerd voor mutagenese ²¹ en de gevoeligheid van het gen mutaties is goed gekarakteriseerd, zodat er een duidelijk begrip van de aminozuurresten die een fenotypische reactie op een chromogeen substraat ^22-25 genereren.

Andere muismodellen voor mutatie detectie omvatten het gebruik van de ΦX174 of LacZ transgenen. De ΦX174 transgeen muismodel, met de originele A: T → G: C terugkeer mutatieassay ²⁶ of de forward mutatie assay ²⁷ dat maakt de ontdekking van een spectrum van substituties van baseparen, betekent een minder kostbaar systeem dan de LacI model. Echter, het mutatie-scherm in de forward test is niet triviaal en de mutatie spectrum van de ΦX174 transgen is minder goed gekarakteriseerd als die van de Lacl. In muismodellen dragen LacZ transgenen, wordt de LacZ mutatie-verslaggever hersteld met behulp van E. coli gastheercellen die gevoelig galactose en medium met galactose ²⁸ zijn. Een nadeel van dit systeem is dat het herstel van het LacZ doel ook betrekking restrictie endonuclease digestie gevolgd door ligatie en elektroporatie van E. coli gastheer, waardoor het moeilijk is om het systeem aan te passen voor kleine aantallen cellen. Hoewel het geen absoluut vereiste voor de bewerking van stam / voorlopercellen celpopulaties (men altijd beginnen met meer muizen), als grote aantallen cellen zijn (bijv. miljoen of meer) zal snel onpraktisch en duur is geworden. Ook de relatief grote omvang van LacZ, terwijl een mutatie gevoelige reporter, is omslachtig en kostbaar voor DNA-sequentieanalyse en bepaald tenzoek van mutatie spectra. Een groot voordeel van dit model is echter het vermogen om grote deleties en inserties detecteren en chromosomale herschikkingen.

Aangezien alle cellen in de Lacl, LacZ ΦX174 en transgene muismodellen dragen de reporter systeem, kan elk van deze muizenmodellen worden gebruikt om mutagenese te meten op elk celtype, waaronder stamcellen en progenitorcellen, zolang zij betrouwbaar kunnen worden geoogst en in voldoende aantallen. Omdat we veel ervaring met de LacI muismodel en de LacI mutatie assay, hebben we besloten om dit systeem verder voor mutagenese analyse voort te zetten in de hematopoietische stamcellen en populaties.

De hematopoietische weefsel is goed gekarakteriseerd in termen van celoppervlak fenotype van de individuele componenten, inclusief langdurige herbevolken stamcellen, die herkenbaar zijn als de uiterst zeldzame bevolking van Lin zijn ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– cellen ^29. . Mohrin et al. ⁴ aangetoond dat de iets grotere populatie van LSK/Flk2 ^– cellen zijn nog steeds goed vertegenwoordigers voor HSC en significant verschillend van de meest primitieve gecommitteerde myeloïde voorlopercellen (CMP) bevolking als het gaat om het bestuderen van DNA-herstel. Bovendien, wanneer de HSC-verrijkte LSK (Flk-2 ⁺ en Flk-2 ^-)-cellen vergeleken met de Lin ^– IL7R ^– Sca-1-cKit ^{+ +} (LS-K progenitorcellen), was er nog steeds een significant verschil in NHEJ vermogen ⁵ tussen de minder zuiver, stamcellen verrijkte LSK bevolking en de voorlopercellen. In ons onderzoek gebruiken we HSC-verrijkte LSK (Flk-2 ⁺ en Flk-2 ^-) cellen omdat we vonden dat ten minste 2 x 10 ⁵ cellen voor consistente, betrouwbare resultaten in deze bepaling mutagenese, dit aantal cellen is uiterst moeilijkte verkrijgen als men sorteert de LSK/Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 bevolking of zelfs de LSK/Flk2 ^– bevolking (in termen van muizen, kosten en uitvoerbaarheid). Dit protocol, gebaseerd op een oorspronkelijk ontwikkeld door Kohier et al.. ¹⁸ beschrijft in detail hoe de spontane mutatiefrequentie DNA kan worden bepaald LSK cellen en gedefinieerde populaties van myeloïde cellen gedifferentieerde en voorspannen beenmerg en milt cellen.

Protocol

Leukocyten uit Lacl transgene muizen op een C57BL / 6 achtergrond niet tot expressie Sca-1 (Figuur 1). Daarom, als Sca-1 een merker voor cel zuivering moeten deze muizen worden gekruist met een geschikte stam Sca-1 expressie te verkrijgen, in dit protocol de F1 van een kruising tussen normale C57BL / 6 (B6) muizen en Lacl (C57BL / 6) transgene muizen (Lacl) werd gebruikt (figuur 1). Van de celpopulaties die in dit protocol, LSKs en CMP's vertegenwoordigen …

Representative Results

De in vivo mutagenese test meet een zeldzame gebeurtenis (mutant pfu's) onder vele evenementen (alle pfu's). Door het uitvoeren van de assay met klein aantal cellen, is het mogelijk dat het resultaat sterk wordt beïnvloed door vals-positieve en vals-negatieve resultaten. Om dit probleem aan te pakken hebben we een seriële verdunning experiment met niet-gefractioneerde beenmergcellen, geoogst uit drie verschillende dieren. We maten de mutant frequentie in het beenmerg van dieren die met 1,4 x 10 …

Discussion

De in vivo mutagenese test hierin beschreven is het Lacl transgene muismodel oorspronkelijk gegenereerd door Kohier et al.. ¹⁸ Dit model maakt gebruik van een λ faag vector die een lacl reportergen. De twee cos plaatsen aan weerszijden van de vector zodat een relatief eenvoudige terugwinning en daaropvolgende verpakkingsmateriaal infectieuze faagdeeltjes, gebruikt infecteren E. coli. Een blauwe plaquette zal worden gegenereerd door faag-geïnfecteerde <em…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880