Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.
Abstract
In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden.
LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen.
LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen – IL7R – Sca-1 + + + cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.
Introduction
In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können sie mehrere genomische (potentiell schädlichen) Störungen, die durch ihre Nachkommen vererbt werden können, zu erwerben. Zu verstehen, wie Stammzellen si-chern ihr Genom während der Lebensdauer eines Organismus ist eine wichtige Frage und kann uns helfen zu verstehen, warum genomische Instabilität wird mit Krebs und einigen anderen altersbedingten Krankheiten (in 1,2 bewertet) verbunden ist.
<p class = "jove_content"> Controlling genomischen Integrität eines Gewebes auf der Ebene von Stammzellen und frühen Vorläuferzellpopulationen entweder durch Eliminierung defekter Stamm (oder Vorläufer-) Zellen durch Zelltod, Seneszenz oder Differenzierung und / oder Reparatur effizienter erreicht werden geschädigter DNA. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, bestimmte Arten von DNA-Reparatur direkt in diesen seltenen Populationen 3-6 messen. Es wurde gefunden, daß beispielsweise in den blutbildenden Systems, Doppelstrang-DNA-Brüche können durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologen Ende repariert werden (NHEJ), wobei letztere eine Reparatur des unteren Treue und damit eine erhöhte Gefahr, dass Fehler. Beide werden in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) 4,5 verwendet, jedoch bei Mäusen scheint es überwiegend NHEJ in der Erwägung, dass HSCs frühen Vorläuferzellen nutzen HR 4. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Stammzellen in der Haut 6 hergestellt. Interessant ist, dass in der menschlichen Blutstammzellen HR, NHEJ nicht,scheint der Reparaturmechanismus der Wahl für die Doppelstrangbrüche 3 sein. Ob diese funktionelle Unterschied zwischen den zwei Arten ist real oder nur eine technische oder experimentellen Unterschied, bleibt abzuwarten.Repertoire eine Stammzelle zur Reparatur beschädigter DNA ist wahrscheinlich andere DNA-Reparaturmechanismen, wie Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und Mismatch-Reparatur (MMR) enthalten. BER und NER sind für die Reparatur von einem oder mehreren Basenpaar Läsionen in Einzelstrang-DNA verantwortlich, während MMR-Fixes Basen-Basen-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen, diese Arten von DNA-Schäden kann nicht durch NHEJ oder HR repariert werden. Unterstützt wird dieser Begriff gibt mehrere Studien aus dem blutbildenden Systems, die einen Zusammenhang zwischen Veränderungen in einem dieser Wege und Anomalien in der HSC Fach 7-9, sowie einem erhöhten Risiko der Entwicklung von myelodysplastischen Syndroms 10-16, eine Krankheit, die im UrsprungHSC und dass mit zunehmender genomische Instabilität wie die Krankheit fort 17 zugeordnet. Bis jetzt wurden Messungen der BER, NER und MMR direkt in HSCs nicht berichtet.
Zusätzlich zur Verdeutlichung der verschiedenen Prozesse, die Gewebeintegrität in einem mechanistischen Pegel zu steuern, ist es unerlässlich, um das Ausmaß der mutierten DNA zu messen, so dass die Folgen von Aberrationen in einem dieser Verfahren kann getestet werden, z. B. in normalen gegenüber genetisch entwickelt, Stammzellen oder in alt gegen jung. Allerdings ist die Entwicklung einer entsprechenden Assay wegen des Mangels an gewebespezifische Stammzellen und das Fehlen von Kulturbedingungen, die "stemness" bewahrt schwierig. Darüber hinaus sollte ein solches Assay abänderbar, um umweltbedingte und genetische Manipulationen. Eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen und Anforderungen ist die Verwendung von Maus-Modellen, die spezifisch entworfen sind, um DNA-Mutationen zu detektieren.
MulFach-transgene Mausmodelle für den Mutationsnachweis wurden entwickelt. Zum Beispiel LacI transgenen Mäusen 18 führen einen erzielbaren λ-Phagen-Vektor, der das LacI Reportersystem, in dem die LacI Gen kodiert für ein Suppressor der Lac-Operator und dient als Reporter Mutation kodiert. Nach Mutation des lacI-Gens, wird der lac-Operator aktiviert und β-Galaktosidase hergestellt wird. β-Galactosidase spaltet das chromogene Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), der es blau wird. Die cos-Stellen flankieren den LacI Vektor erlaubt die einfache Wiederherstellung von Lambda-Phagen-Proteine und anschließende Infektion von E. coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die die X-gal-Substrat enthält, kann Plaques erzielt werden. Blaue Plaketten enthalten eine mutmaßliche Mutanten-Lac-I Durchführung Phagen, während klare Plaques Hafen nicht-Mutanten. Die Häufigkeit der blaue Plaques (unter the klar sind) gibt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Darüber hinaus kann die λ-Phagen-Hosting lacI Ziel leicht sequenziert werden unter Verwendung von PCR-Techniken für relativ hohe Durchsatzanalyse. Die Sequenzierung mehrere mutierte Gene LacI wichtige Informationen über das Mutationsspektrum, die wiederum auf mögliche Mängel in bestimmten DNA-Reparaturwegen oder auf bestimmte gentoxische Ereignisse zeigen offenbaren. LacI transgenen System über mehrere Laboratorien 19 standardisiert und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Ein Hauptnachteil des lacI-System ist die begrenzte Möglichkeit, große Deletionen oder Umordnungen nachzuweisen, weshalb andere Verfahren, z. B. Mehrfarben-FISH an Metaphasespreitungen müssen verwendet werden, um diesen Mangel zu ergänzen sein.
Innerhalb des λ-Phagenvektor des lacI-Mausmodell, gibt es eine viel kleinere Gen CII, Für die Mutationsanalyse zur Verfügung. Die Größe und die Tatsache, daß Mutanten können ausgewählt werden, macht dies zu einer weniger arbeitsintensiven und kostengünstiger als der Assay 20 lacI-Gen-Analyse. Jedoch wird das lacI-Gen umfassender zur Mutagenese 21 und der Empfindlichkeit des Gen-Mutationen untersucht worden ist und dadurch, dass es eine klare Verständnis der Aminosäurereste, die eine phänotypische Reaktion auf ein chromogenes Substrat 22-25 zu erzeugen.
Andere Maus-Modelle für den Mutationsnachweis umfassen die Verwendung der &PHgr; X174 oder das lacZ-Transgen. Die &PHgr; X174 transgenen Mausmodell, mit dem Original-A: T → G: C-Reversion-Mutationstest 26 oder die Vorwärtsmutationstest 27 die Erkennung von einem Spektrum von Basenpaar-Substitutionen, stellt eine weniger kostspielige System als die LacI Modells ermöglicht. Allerdings ist die Mutations Bildschirm in der Vorwärts Assay nicht trivial und die Mutation spectrum des &PHgr; X174 Transgen nicht wie die des LacI gut charakterisiert. In Maus-Modellen trägt LacZ Transgene wird die Mutations LacZ Reporter erholt Verwendung E. coli-Wirtszellen, die empfindlich auf Galaktose und Galaktose-Medium 28 enthalten sind. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die Wiederherstellung des LacZ Ziel beinhaltet auch Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von Ligation und Elektroporation von E. coli-Wirte, wodurch es schwierig wird, das System für eine kleine Anzahl von Zellen anzupassen. Obwohl es nicht eine absolute Voraussetzung für die Arbeit mit Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen (kann man immer mit mehr Mäuse beginnen), wenn eine große Zahl von Zellen erforderlich sind (zB Millionen oder mehr) es wird schnell unpraktisch und kostspielig geworden. Auch die relativ großen Abmessungen von LacZ, während ein empfindlicher Mutations Reporter, ist umständlich und kostspielig für die DNA-Sequenzanalyse und determfung der Mutation Spektren. Ein Hauptvorteil dieses Modells ist jedoch seine Fähigkeit, große Deletionen und Insertionen zu detektieren, sowie chromosomale Rearrangements.
Da alle Zellen in lacI, &PHgr; X174 und LacZ transgenen Mausmodellen führen das Reportersystem kann jeder dieser Mausmodelle verwendet werden, um die Mutagenese in jedem Zelltyp von Interesse zu messen, einschließlich der Stamm-und Vorläuferzellen, solange sie zuverlässig entnommen werden können und in ausreichender Zahl. Weil wir umfangreiche Erfahrung mit der LacI Mausmodell und dem LacI Mutationstest, haben wir beschlossen, dieses System weiter für die Mutagenese-Analyse in hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferpopulationen zu verfolgen.
Die blutbildenden Gewebe ist gut charakterisiert hinsichtlich der Zelloberfläche Phänotyp der einzelnen Komponenten, einschließlich der langfristigen Bestandsauffüllung Stammzellen, die erkennbar der extrem seltenen Bevölkerung von Lin sind – IL7R <sup> – Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 – CD150 + CD48 – Zellen 29. . Mohrin et al 4 gezeigt, dass die Bevölkerung von etwas größer LSK/Flk2 – Zellen sind immer noch gute Vertreter für HSK und die erheblich von den primitivsten engagierte myeloischen Vorläufer (CMP) Bevölkerung, wenn es um das Studium der DNA-Reparatur kommt. Wenn darüber hinaus die HSC-angereicherten LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -) – IL7R – Zellen wurden zum Vergleich Lin Sca-1-cKit + + (K LS-Vorläuferzellen), gab es immer noch einen signifikanten Unterschied in NHEJ Fähigkeit 5 zwischen der weniger rein, Stammzell-angereichertem LSK Bevölkerung und die Vorläuferzellen. In unserer Studie verwenden wir HSC angereicherte LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -)-Zellen, weil wir festgestellt, dass mindestens 2 x 10 5 Zellen für konsistente, zuverlässige Ergebnisse in dieser Mutagenese-Assay erforderlich, das die Zellzahl ist äußerst schwierig,zu erhalten, wenn man die LSK/Flk2 sortiert – CD150 + CD48 Bevölkerung oder auch die LSK/Flk2 – Bevölkerung (in Form von Mäusen, Kosten und Praktikabilität). Dieses Protokoll basiert auf der ursprünglich von Kohler et 18 al. Entwickelt beschreibt im Detail, wie die spontane DNA-Mutantenfrequenz in LSK Zellen differenzierten Populationen von myeloischen Zellen sowie nicht getrennten Knochenmark und Milz-Zellen bestimmt und definiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von 18 Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten David R. Rodriguez, MA für die Grafik-Design und Fotografie in diesem Manuskript danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem GCCRI, dem NIH / NIA (5R21AG033339) und dem Cancer Center Support Grant (P30CA054174) an die UTHSCSA Durchflusszytometrie Core-Anlage und der UTHSCSA Erweiterte Nucleic Acids Core Facility unterstützt.
Materials
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | |
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 |
| 0.025 mM pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 |
| 245 mm2 bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 |
| Agar | Fisher | BP1423-500 |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 |
| N, N-dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/coulter | A63880 |
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