3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする
Summary
この記事では蛍光さらなる修正と3D細胞培養のライブイメージングの両方に使用することができコラーゲンにラベルを付ける方法を紹介します。また、3D環境で培養された細胞の内因性細胞骨格タンパク質を可視化するために最適化されたプロトコルを提供する。
Abstract
細胞遊走は、伝統的に、2D基板で研究されている。しかし、それは、問題の生理学的プロセスの次元に似て良い、より適切な3D環境での細胞遊走を研究する必要があることがますます明らかになっている。遊走細胞は、実質的に、彼らは2Dまたは3Dの基板上に移動しているかに応じてその形態と移行のモードで異なる場合があります。 3Dマトリックス内に埋め込まれた細胞のほとんどは標準プロトコル、構造及び機能解析と技術的な問題と互換性がないため、まだ珍しいのまま。この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞の移行のための適切なECM基板として、我々は、私は室温で重合し、蛍光共焦点顕微鏡の標準を使用して可視化を容易にするためのラベルnonpepsinizedラット尾コラーゲンを使用しています。この作品はまた、protocを含む内因性の細胞骨格の3D免疫標識OL。我々は、分子組成、ローカリゼーション、および3Dで細胞構造の機能のより良い記述に貢献したいと考えて、これらのプロトコルを使用する。
Introduction
細胞移動の分野では、ブランドの新しい三次元の世界に勇敢に立ち向かうされています。これは、最も近い3次元（3D）、したがって、生理1に似ており、環境内の細胞遊走を研究する直感的である。しかし、技術的な制限により、ほとんどの細胞遊走試験は、未処理又は適切な細胞外マトリックス（ECM）タンパク質で被覆されたいずれかの剛体二次元（2D）基板を横切って細胞運動を解析することが行われている。
三次元コラーゲン格子において細胞遊走に捧げ最初の研究は20年以上戻って1-3行く。ただし、過去5年間では遊走細胞が実質的にその形態や基板の次元に応じて、移行のモードで異なる可能性があることが明らかになった。 2Dで、細胞が広いだけで平坦突起の形成（葉状）、その結果、接着斑を使用して、腹面を有する基板に連絡彼らのリーディングエッジに埋め込まれた指状の突起（糸状仮足）。これらの構造体は、一緒に後縁へのセル前面を接続するストレスファイバーと、2Dで細胞運動のために重要であると考えられている。 3Dマトリックス中に、細胞が形成し、これらの構造の多くの機能的関連性にかなりの変化を引き起こし、ECMを接触全体細胞表面と、一般的に細長いある。逆に、他の細胞の機能は、このようなECMリモデリング4に関わる核変形や構造などの3D移行に関連性を得ることができます。
これらの既知の形態学的変化、ならびにECMおよび細胞型に応じて変化し得る5-7移行モードの違いは、3Dマトリックス内に埋め込 まれた細胞の構造的および機能的な解析にもかかわらず、依然として異常なままである。太く密3D行列の操作技術などの高解像度の顕微鏡イメージングなど困難、最も安定して非互換性を運ぶndardプロトコルは、内因性タンパク質の免疫蛍光ラベルのように、2次元文化のために最適化されています。 3Dマトリックスの使用は比較的新しいアプローチであるため、また、研究者は依然として密接な異なる組織器官の正常な間質アーキテクチャまたは腫瘍の周囲のECM組織として生体内の状況で特定の似ているように最高の条件を調査している。異なるグループに関する検索結果の矛盾は、例えば、癌細胞の遊走のモードや接着斑の存在は、いくつかの論争8を生成した。多くの努力が最近ECM化学的性質、細孔径、繊維の太さ、およびマトリックス剛性の点で合意に達するために専念してきました。 3D ECMは多くの異なるタイプの現在市販されているマトリゲルに細胞由来のマトリックスを変化させ、使用されている、pepsinizedウシコラーゲンI、またはnonpepsinizedラット尾部コラーゲンI.は、これらの行列の各々は、特定の物理的および化学的性質を有し、相対する1つのニーズ検討されて生理的プロセスに最適なTEが行列。また、細孔径および繊維の厚さは、例えばpH及び温度9,10等の重合条件に依存することができる。にとガラスのようなリジッド基板からの距離バインド、またマトリックス10,11の弾性特性を変更することができます。
この記事では、単一の細胞またはスフェロイドとして、3Dがん細胞培養の準備及びイメージングのための方法が記載されている。癌細胞スフェロイドの製造方法は、以前に、ハンギングドロップ法12,13およびアガロースでコーティングされたプレート法14、最も人気のあるものに記載されている。癌細胞の移動に適したECMの基板として、Iは室温で重合nonpepsinizedラット尾コラーゲンは2 mg / mlのに使用される。 Nonpepsinized酸抽出したコラーゲンラット尾から私は両方のN-およびC-末端テロペプチド、天然コラーゲンintermolecの責任コラーゲン分子のnonhelical部分を保持ウラル架橋とfibrilar安定性15。併せて、これらの条件に最も近いインビボ 10 で観察されたものに似たコラーゲンネットワークの形成を可能にする。詳細なプロトコルは、蛍光5を用いたin vitro 10 中のコラーゲンを標識するために設けられている固定および培養物中で生きている、コラーゲン繊維の視覚化を可能にする- （および-6） -カルボキシテトラメチルローダミン（TAMRA）、スクシンイミジルエステル。このプロトコルはBaici らから適応されています。フルオレセインイソチオシアネートは、水溶性のコラーゲン分子を標識するために使用されている16,17。フルオレセインとして、TAMRAは、例えば、N末端の遊離アミノ基と、より重要なのは、リシンの側アミノ基のようなタンパク質のnonprotonated脂肪族アミノ基と反応するアミノ反応性蛍光色素である。リジンアミノ基がnonprotonated形態である場合、この反応は、塩基性のpHで起こる。 TAMRAに加えて上のフルオレセインよりも安定している時間は、その発光スペクトルは便利GFPタグ融合タンパク質の生細胞イメージングのために組み合わせることができ、赤/オレンジレンジ（EX / EM = 518分の555 nm）で、上に落ちる。アミノ反応性色素でラベルされた可溶性コラーゲン分子を使用すると、重合プロセスでも密度、細孔径とコラーゲンマトリックス10,16,18,19の架橋状態には影響を与えません。
このプロトコルは、さらに細胞骨格や細胞骨格に関連するタンパク質を標識するために最適化された内因性タンパク質の三次元免疫ラベリングするための方法も含まれています。このプロトコルの最終的な焦点は、コラーゲンマトリックスの張力に硬質ガラス製カバースリップの低減に寄与共焦点顕微鏡を用いた3次元培養物の高解像度の画像を取得する方法である。
Protocol
Representative Results
Discussion
私はTAMRAを使用蛍光ラベルコラーゲンにここで説明するプロトコルは、561 nmのレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を使用することにより、コラーゲンネットワーク組織を簡単に可視化を可能にする優れた方法を提供します。反射率共焦点顕微鏡と比較して、この技術の利点は、三次元マトリックスに深く画像コラーゲン繊維の能力である。繊維反射の強度およびコントラストは、レー?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者は感謝した画像は、 図3とPICT-IBISAイメージング機能（研究所キュリー）で取得して処理するために博士ワシーリーGurchenkov（キュリー研究所）を認める。 in vitroで細胞のモデルでコンプレックス-この仕事はANR-09-JCJC0023-01、ARC SFI20111203863とPIC 3Dによってサポートされていました。
Materials
| TAMRA, SE | Invitrogen | C-1171 | |
| Rat tail Collagen High Concentration | BD Biosciences | 354249 | |
| Rat tail Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Phalloidin | Sigma | P2141 | |
| Taxol (Paxitel) | Sigma | T7402 | |
| Mouse anti-alpha Tubulin antibody | Sigma | T9026 | |
| Alexa 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody | Invitrogen | A21052 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Mounting media | Fisher Scientific | 106 226 89 | |
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Dialysis Cassette | Pierce | 66380 | |
| Glass bottom dishes | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Imaris 7.2.3 | Bitplane |
Riferimenti
- Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
- Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
- Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
- Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
- Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
- Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
- Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
- Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
- Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo?. Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
- Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
- Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
- Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
- Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
- Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
- Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
- Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
- Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
- Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
- Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).
